从分子角度理解细胞色素P450偶联效率以及工程化改造的策略

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细胞色素P450(Cytochrome P450s)是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白,其可以催化多种氧化反应,比如羟基化、环氧化、磺化等。由于可以有效氧化惰性碳,P450在药物和生物合成领域具有巨大的潜力。然而,细胞色素P450在催化过程中经常遇到低偶联效率的问题,从而限制了其在生物催化以及工业化中的广泛应用。偶联效率描述了细胞色素P450利用辅因子NAD(P)H的能力。低偶联效率意味着昂贵的辅因子NAD(P)H在反应过程中会有额外消耗,并生成解偶联副产物,如水(H2O)、过氧化氢(H2O2)以及超氧离子(O2-)等。尤为严重的是,在反应过程中生成的活性氧副产物会不断积累,最终造成P450酶和用于表达P450酶的工程菌失活。

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图1. 通过理性设计底物结合口袋、配体访问通道和电子传递链来改造细胞色素P450酶的偶联效率。图片来源:Biotechnol. Adv.

近日,德国亚琛工业大学团队综述了理性设计具有高偶联效率的P450酶的工程化方法。研究人员从酶结构和催化机理出发,提出了三类改造P450酶的设计策略:

(1) 稳定P450s 的结合口袋中底物:高偶联效率需要P450的结合口袋与底物之间具有良好的“互补性”。一方面,合适的结合口袋有利于将底物稳定在正确的取向,以便血红素进行后续的氧化。另一方面,如果底物与结合口袋互补性较差,大量的水分子会涌入结合口袋,导致形成解偶联产物。简言之,稳定结合口袋的关键在于限制结合口袋中的底物运动,使其处于正确的催化构象。

(2) 利用配体访问通道调节底物/产物和水的运输:细胞色素P450的活性位点埋藏在酶的内部,其催化过程中需要通道来调控底物/产物和水的进出。因此,合适的通道对提高偶联效率极为关键。低效的通道会限制底物和产物的运输,造成底物/产物冗积在结合口袋中,最终导致P450反应流向解偶联途径。另外,藉由通道进入结合口袋中的过量水可作为质子供体,导致解偶联产物的形成。因此,“协调底物/产物有序运输”和“限制水分子扩散”两种策略可用于提高 P450s 耦合效率。

(3) 工程化电子传递链:电子传递一般是P450反应的限速步骤。如果电子供应不足,P450将倾向于生解偶联产物。然而仅有很少的研究针对于工程化P450的电子传递链。优化P450的电子传递有两种方法,第一种是针对电子传递链上的残基进行改造,特别是流向血红素辅因子的一小段电子传递链。第二种方法是改造影响 P450 血红素结构域和还原酶结构域之间相互作用的残基,例如连接子(linker),这同样可以有效地影响电子传递链的性能,进而提高耦合效率。


基于细胞色素 P450 的结构,可以在计算机上预测潜在的功能化区域,包括结合口袋、配体通道和电子传递链。随着对P450酶的的结构-功能关系的理解的加深,可以预期,蛋白质工程师们能够设计出更高效、更强大的 P450酶,并促进 P450 在药物和生物合成领域中的工业应用。

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图2. 用于工程化改造细胞色素P450的最新技术。图片来源:Biotechnol. Adv.

Biotechnol. Adv.2022, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2022.108051

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