蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂

——背景——

蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程属于翻译后修饰，可以影响蛋白的构象、改变蛋白的功能等，在生物信号转导上有着重要的作用。蛋白磷酸化与去磷酸化过程由蛋白激酶和蛋白磷酸酶两大类酶调控，其中蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases，PTKs）和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）共同维持酪氨酸蛋白磷酸化与去磷酸化的平衡，调控机体细胞的生长、分化、代谢、基因表达转录和免疫应答等过程；而当两类酶之间平衡紊乱会使机体内蛋白磷酸化状态异常，则可能导致肿瘤的发生与发展以及其他多种疾病。此前，抑制PTKs活性已经成为肿瘤靶向治疗最常用的策略之一，FDA相继批准多个小分子PTKs抑制剂作为抗肿瘤药物上市，如伊马替尼（imatinib）、吉非替尼（gefitinib）、瑞格菲尼（regorafenib）等，而关于PTPs的抑制剂在抗肿瘤领域的研究则相对较少。本文就SHP2的结构与功能及其相关抑制剂的研究进展进行概述。

——SHP2结构与功能——

SHP2（Src homology 2 containing protein tyrosine phosphatase2）是由PTPN11基因编码的一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，主要由N-SH2，C-SH2，PTP活性中心与C末端两个Tyr磷酸化位点（Tyr542和Tyr580）尾巴等结构域构成。它是多种细胞因子、生长因子及其它胞外刺激的胞内信号转导分子，参与细胞增殖、迁移、分化等重要的生理过程。SHP2不仅参与Ras/Erk、PI3K/Akt、JAK/STAT等多个致癌信号转导级联通路（Fig.1左），还参与调节PD-1/PD-L1免疫检查点通路，促进免疫逃逸（Fig.1右）。

Fig.1 SHP2参与的信号通路（Wu J, et al. 2020）

如Fig.2的结构显示，在非活性状态下，SHP2的N-SH2结构域与PTP结构域结合会阻断其底物进入催化位点，无法发挥磷酸酶功能。而当SHP2与特定的pTyr基序结合时，蛋白构象发生变化，N-SH2结构域远离PTP域，SHP2的自抑制状态被破坏，变构为开放构象，发挥磷酸酶的功能。此外，在某些突变型中（如E76K），SHP2可能不会保持自抑制的构象，N-SH2、C-SH2和PTP域会有不同程度的开合，不同构象均会影响SHP2的磷酸酶活性。

Fig.2 SHP2蛋白的晶体结构（PDB：2SHP，其中蓝色区域为N-SH2结构域，红色区域为C-SH2结构域，黄色区域为PTP结构域）

人源PTPN11共编码593个氨基酸，目前已被证实是一种原癌基因，其异常表达会导致某些疾病与部分实体瘤的发生与发展（Fig.3），SHP2现已是治疗癌症的潜在靶点，且至今暂无一款上市的药物，其抑制剂的开发成为了当前抗肿瘤药物研发的热门领域之一。

Fig.3 SHP2突变型与人类疾病（Huang WQ,et al. 2014）

（NS：Noonan综合征；JMML：儿童慢性粒细胞白血病；MDS：儿童骨髓增生异常综合征；AML：儿童急性粒细胞白血病；ALL：儿童急性淋巴细胞白血病；LS：Leopard综合征）

——SHP2抑制剂——

SHP2抗肿瘤活性抑制剂根据作用方式不同可分为正构抑制剂和变构抑制剂，此外新型的蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimeras，PROTACs）技术也在SHP2的研究中逐渐被应用。

一、正构抑制剂。传统的SHP2抑制剂设计思路是从其正构位点（PTP催化活性中心）着手，即靶向PTP域的催化口袋，阻止pTyr底物进入催化位点，从而抑制SHP2的磷酸酶活性。此类抑制剂结构中含有磺酸基、硝基、羧基等酸性、极性基团，主要分为以下几种结构类型：（1）磺酸苯肼基吡唑啉酮类，代表化合物为PHPS1；（2）喹啉肼类，代表化合物为NSC-87877；（3）吲哚酮类，代表化合物为NSC-117199；（4）水杨酸类，代表化合物为II-B08；（5）其他类结构，如隐丹参酮（cryptotanshinone）等（Fig.4）。

Fig.4 SHP2正构抑制剂的结构式（Song Z, etal. 2021）

虽然早期关于SHP2正构抑制剂的研究较多，但因为非受体型PTPs（如SHP1、PTP1B）具有高度保守性，这导致了针对PTP域设计的小分子抑制剂具有较低的选择性；而且占据PTP催化位点则要求抑制剂必需的高电性、大极性基团也导致此类小分子抑制剂存在细胞透膜性差和口服生物利用度低等问题。

二、变构抑制剂。由于正构抑制剂存在诸多问题，SHP2过去一度被认为是“不可成药”靶点，直到SHP2变构抑制剂逐渐走进了科研人员的视线才改变了这种观点。SHP099的报道是小分子SHP2变构抑制剂的一项里程碑，其作用于N-SH2、C-SH2、PTP三个结构域的界面处的“隧道口袋”（Fig.5），同时也改变了之前针对PTP域研发小分子抑制剂的策略。

Fig.5 SHP2隧道口袋（Garcia FortanetJ, et al. 2016）

诺华（Novartis）通过高通量筛选的方法找到了SHP2弱抑制剂SHP836（IC₅₀=12 μM），通过X射线发现其结合位点在“隧道口袋”，而非PTP结构域，这种结合方式稳定了SHP2的非活性自抑制构象，无法发挥磷酸酶功能。随后诺华的研究人员以SHP836为苗头化合物通过结构修饰与改造得到选择性与活性较好且具有良好口服生物利用度的化合物SHP099（IC₅₀=0.07 μM），但在后续的研究中发现SHP099具有剂量依赖的光毒性，而后对其进行了进一步的结构优化、提升理化性质、降低光毒性并最终得到了化合物TNO155（IC₅₀=0.011 μM）。

Fig.6 SHP836、SHP099、TNO155的结构式（Matthew J. LaMarche, et al.2020）

除了诺华外，赛诺菲（Sanofi）、加科思（Jacobio）等公司也均在SHP2抑制剂方面进行了布局，目前进入临床阶段的小分子SHP2变构抑制剂如Tab.1所示。

上述变构抑制剂大多对于SHP2^WT有较好的抑制活性，但对于一些突变型，如SHP2^E76A，SHP2^G60V，SHP2^S502P等的抑制活性可能略逊于SHP2^WT，如抑制剂SHP099对SHP2^E76A（IC₅₀=0.124 μM）的抑制活性弱于SHP2^WT（IC₅₀=0.063 μM）（Tang K, et al. 2020）。Fig.3中显示了不同SHP2突变型对应的不同疾病，针对不同的适应症，以不同SHP2突变型为靶点设计变构抑制剂，可能会具有更好的效果。

三、PROTAC技术在SHP2的应用。近年来随着PROTAC技术的兴起，其在诸多“不可靶”或“难靶”蛋白的降解上应用越来越多。PROTAC是一种双功能小分子，一端是结合靶蛋白的配体（弹头分子），另一端是结合E3泛素连接酶的配体，两者通过一段链（Linker）连接。它可同时结合靶蛋白和E3连接酶形成三元复合物，利用机体内的泛素蛋白酶体系统，促进靶蛋白的泛素化并导致其被蛋白酶体降解。

SHP2-D26是第一个有效降解SHP2的PROTAC，其胞外抑制Erk去磷酸化水平以及抑制细胞生长活性均优于SHP099。研究人员根据SHP099及SHP394先行设计了新的SHP2变构抑制剂，通过蛋白共晶结构发现苯环间位处于溶剂暴露区，是理想的Linker连接位点（Fig.7蓝色结构）；E3连接酶配体则选用较为成功的VHL-1/cullin 2复合物配体，该复合物已用于雄激素受体和雌激素受体的PROTAC（Fig.7黑色结构）；随后经多次优化筛选确定了Linker的长度与结构（Fig.7红色结构），最终得到SHP2-D26。

Fig. 7 SHP2-D26的结构（Wang M, et al.2020）

除了SHP2-D26外，最近报道的SP2-SP5系列PROTAC也是基于SHP099的结构为出发点。与SHP2-D26不同的是，研究人员直接以SHP099作为弹头分子，并以哌啶环作为Linker连接位点，E3连接酶选用CRBN，配体则为CRBN常用配体度胺类化合物—泊马度胺（pomalidomide），通过不同长度的Linker连接合成了共4个化合物SP2-SP5（Fig.8）。其中SP4对Hela细胞的生长有显著的抑制作用，与SHP099相比其活性提高了100倍，此外SP4还能显著诱导SHP2降解和细胞凋亡。

Fig. 8 SP2-SP5的结构（Zheng M, et al.2021）

——小结——

蛋白质的磷酸化与去磷酸化的过程在生物信号转导上起着重要的作用，而SHP2是维持这一过程平衡的重要磷酸酶，还参与调节免疫检查点通路，这使得SHP2成为具有巨大潜力的抗肿瘤靶标。虽然目前SHP2靶点抑制剂暂无一款上市成药，进入临床阶段开发的抑制剂也相对较少，但由于其在肿瘤生长和免疫中发挥的重要作用，关于SHP2的研究已逐渐火热，此外，SHP2变构抑制剂的发现以及PROTAC技术在降解SHP2上的应用，这也使得靶向SHP2治疗肿瘤的策略变为可能。期望未来抑制SHP2活性将成为肿瘤靶向治疗的一种有效方案。

 

参考文献

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