ADC药物分子设计的基本考虑

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ADC药物分子设计的基本考虑   第1张

肿瘤细胞与正常细胞最根本的区别,在于它的原癌基因或抑癌基因发生了突变,这些突变有可能导致其产生肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigens, TSAs)和肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens, TAAs)


TSA是指肿瘤细胞有而正常细胞没有的抗原,而TAA是指二者都有但在肿瘤细胞中过表达的抗原。TSA和TAA很好地区分了肿瘤细胞和正常细胞,于是单克隆抗体疗法出现了。


早期的单抗都是鼠源或嵌合抗体,因此免疫原性就比较强,再加上抗体分子量较大,导致其肿瘤渗透率很差。后来抗体工程的发展解决了这些问题,但是单克隆抗体对肿瘤的治疗效果还是不尽如人意。


于是,人们将抗体的特异性和化疗药的毒性结合到一起,产生了抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs)。ADC主要由三个部分组成:抗体、连接子和毒素。


早期的ADC利用肿瘤微环境的差异性(如特定的酶、pH等)来释放毒素,这种方式导致ADC产生较大的毒性。新型的ADC则是利用细胞的内化作用,转移到细胞内部再释放毒素,从而大大减少了毒性。


本文将带你系统地了解ADC的方方面面,以及它的最新研究动向。


ADC药物分子设计的基本考虑   第2张

ADC的结构
图源:Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225
01
ADC作用机制


胃酸和蛋白酶会对ADC造成破坏,因此它只能通过静脉注射方式给药。ADC进入血液循环后随血液到达全身,当它与肿瘤细胞表面抗原结合后,就会发生内化作用,即细胞膜产生凹陷,最终向内生成一个小球,称内吞体(endosome)

内吞体的外表面包裹着一层网格蛋白,内表面存在一些Fc受体(FcRns),由于H+的内流,内吞体内部形成酸性环境,促进ADC与FcRn的结合,这些与FcRn结合的ADC会被重新运输到细胞外,pH回到了7.4,这时二者又分离,释放出ADC。这一机制可以减少ADC对正常细胞的伤害,但同时也会影响其对肿瘤细胞的作用。FcRn主要表达于内皮细胞的内吞体中。

剩下那些没有结合FcRn的ADC最终保留在内吞体中,随着内吞体与溶酶体的融合,这些ADC被溶酶体中的各种酶降解,释放出毒素分子。这些毒素分子有的直接杀死肿瘤细胞,有的则通过诱导其凋亡将其消灭。此外,将靶细胞杀死后,毒素分子还能继续发挥作用,杀死相邻的肿瘤细胞以及肿瘤的支撑性组织。


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ADC作用机制
图源:Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225

从血液循环到最终释放毒素分子,每一步都会有ADC的损失,因此ADC只有达到一定的浓度,才能保证最后有足够量的毒素分子发生效应。


02
靶点选择

在设计一款ADC药物之前,得先确定靶点。靶点必须是肿瘤特异性的,或者在肿瘤中高表达的。吉妥单抗的失败就是因为它的靶点抗原CD33表达量过低。但是,光满足这一点还远远不够。它还得有足够的能力驱动内化作用,具有较高的表达量以及外显率。

肿瘤特异性抗原是最理想的靶点,但事实上大多数靶点都是肿瘤相关抗原,因此得保证它们在正常细胞中的表达量尽可能地低。

PSMA在正常前列腺细胞中只表达于细胞浆,而在前列腺癌细胞中则会暴露于细胞外;HER2在乳腺癌细胞中高表达,而在正常细胞中表达量很少。因此这两种抗原都可以作为ADC的靶点。

抗原驱动内化作用的能力取决于抗原的种类和毒素分子的种类。有些抗原不管有没有结合抗体,都会频繁地发生内化作用,但有些就一直待在细胞膜上不会动,而前者才可以将ADC带入细胞内。

除了抗原自身与其内化作用相关外,毒素种类也会影响抗原的内化作用。例如,CD20正常情况下不会诱导内化作用,当利妥昔单抗连接阿霉素/澳瑞他汀时,不发生内化,当连接卡奇霉素时又可以发生内化。

还有一种情况,当抗原在肿瘤细胞通路中发挥作用时,影响肿瘤细胞的正常生理功能,从而抑制肿瘤的生长。比如T-DM1中的曲妥珠单抗,在特异性结合HER2后可抑制细胞生长。

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T-DM1作用机制
图源:Clin Cancer Res. 2011 Oct 15;17(20):6437-6447

肿瘤相关靶点最常见的就是位于细胞表面的蛋白,事实上我们还可以把目光放到肿瘤细胞之外的附属组织,比如新生血管和细胞外基质组织,这些组织保证了肿瘤细胞的生长和扩散,因此,破坏这些组织可以间接地抑制肿瘤生长,典型的例子有成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)和蛋白酪氨酸激酶7(protein tyrosine kinase 7, Ptk 7)
03
单克隆抗体选择


抗体的任务是让ADC具有高靶标特异性、高靶标结合力以及在肿瘤部位的持久暴露。基于这些原则,我们选择的抗体:1)不能和正常细胞产生反应,2)活性要在纳摩尔或者皮摩尔级别,3)具有较长的半衰期,4)尽可能小的免疫原性。

ADC的靶标特异性差不仅导致对正常细胞产生毒性,还会因免疫原性加快血浆清除速度。免疫原性是影响血浆清除速度的主要因素。早期的ADC,其抗体都是鼠源或嵌合抗体,因此免疫原性很强,很快就会被清除,无法发挥作用,所以现在使用的抗体基本都是人源化的或者人源抗体。

抗体占ADC总质量的90%以上,抗体的大小决定了ADC的渗透性。血管内皮只有一层细胞,普通血管的分支较少,内皮细胞排列相对紧密,大分子无法透过,但肿瘤组织内的血管分支很多,内皮细胞排列疏松,像ADC这种大分子也可以轻松透过,因此可以较好地进入到肿瘤组织。

与此同时,要保证像肝、肠、皮肤等代谢性和清除性器官不能透过ADC,这样才能将ADC截留在血液循环中,增加其半衰期。除此之外还有一种因素会影响ADC的半衰期,那就是FcRn,ADC-FcRn复合物可以使ADC重新回到血液循环或者肿瘤组织间液中,再次利用。

单抗的作用机制有两种,一种是直接阻断肿瘤细胞的通路(如曲妥珠单抗),另一种则是通过激活免疫细胞来杀死肿瘤细胞,如ADCC、CDC、CDCC等。后者的最终效果很大程度上与抗体的亚型有关,但不管是哪种亚型,都存在各种问题。为此,人们开始设计双特异性抗体,例如卡妥索单抗可同时靶向肿瘤细胞的EpCAM抗原和T细胞的CD3抗原,从而促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

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ADCC、CDC、CDCC机制
图源:Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225
04
连接子


连接子的任务是保证ADC在血液循环中稳定不断裂,而在肿瘤组织中又能断裂释放出毒素分子。在设计连接子时需要考虑:1)连接子的可断裂性2)连接位点3)连接机制。

连接子大致分为可裂连接子和不可裂连接子两种。可裂连接子依赖肿瘤微环境的特异性来使ADC发生断裂。腙连接子利用溶酶体中较低的pH值,发生酸水解,从而释放毒素分子。二硫键连接子容易被谷胱甘肽分解,而肿瘤细胞中的谷胱甘肽含量较高。

还有一种是酶不稳定连接子(或肽连接子),它通过二肽将抗体与毒素分子连接,由于打破肽链的酶只在低pH环境下发挥作用,因此这种连接子不会在肿瘤之外的中性区域断裂。临床试验表明,与腙连接物相比,酶不稳定连接物具有更高的特异性、更高的稳定性和更长的半衰期,因此毒性相对更小。

与之不同的是,不可裂连接子依赖于内化后的溶酶体裂解作用。溶酶体中的蛋白酶分解单克隆抗体的蛋白质结构,最后留下一个氨基酸(通常是赖氨酸或半胱氨酸)仍然附着在连接体和细胞毒素上。由此产生的氨基酸-连接物-细胞毒素复合物释放到细胞质中,成为活性药物。

连接子确定后,还需要确定药物-抗体比率(DAR),按道理DAR值越高效果越好,但事实远非这么简单,过度的药物结合导致ADC容易发生聚集并被识别为外来蛋白,增加其清除率和免疫原性增加。研究表明,每个单抗负载2-4个毒素分子最为合适,在清除率和最大效力之间达到了最佳平衡。

不可裂连接子具有更好的稳定性,因此采用这类连接子的ADC半衰期更长,副作用风险降低,同时保留活性。但另一方面,可裂连接子可能产生一种旁观者效应(bystander effect), 旁观者效应通常是由疏水性细胞毒素的细胞外流引起的,它可以从抗原阳性的靶细胞扩散进入相邻抗原阴性的健康细胞。

尽管旁观者效应破坏了ADC的靶向特异性,但在治疗缺乏靶抗原同质表达的实体瘤时,这种效应却是有利的。旁观者效应仅发生在可裂连接子,因为不可裂连接子分解形成的氨基酸-细胞毒素复合物带电,因此不能穿过靶细胞的疏水性脂质双层。


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连接子的重要作用
图源:Acta Pharmaceutica Sinica B, 2021, 2211-3835
05
偶联技术


传统的ADC偶联方法是将毒素分子直接与抗体连接,通过半胱氨酸的巯基(图A)或赖氨酸的氨基(图B)相连,它的缺点是连接位置和数量受限于抗体蛋白的序列。而且生产出来的ADC质量不一,有的抗体连接上了毒素而有的没连接上,除了影响疗效,没有连接毒素的抗体还会对抗原进行占位,进一步影响ADC发挥作用。

为此,人们在单抗的特定位置引入选择性反应分子,这样可以控制药物附着的部位和数量,并可能增加ADC的治疗窗口,同时降低毒性并改善药代动力学性质。这种策略主要有三种结合技术,分别是:1)通过未配对半胱氨酸残基接合2)通过谷氨酰胺转氨酶接合3)通过非天然氨基酸接合。

通过未配对半胱氨酸残基接合(图C)。这种方法依赖于定点突变,即在单克隆抗体的特定位点引入固定数量的半胱氨酸。这一过程保持了天然半胱氨酸残基之间的二硫键,同时避免了ADC异质性问题。

通过谷氨酰胺转氨酶接合(图D)。这种方法首先将单抗的特定位点修饰为谷氨酰胺,再利用谷氨酰胺转氨酶将含胺的细胞毒素结合到该位点上。它的主要优点是这种酶不识别原本的天然氨基酸,而是与谷氨酰胺标签序列相互作用,该标签序列可通过质粒并入单克隆抗体。由于单抗上可能的结合位点数量增加,这种技术可以更好地控制药物结合。

通过非天然氨基酸接合(图E)。非天然氨基酸在结构上与天然氨基酸非常相似,是利用基因密码子拓展技术,将含有一些生物正交官能团的非天然氨基酸引入到蛋白质中,然后在偶联药物,具有定点可控,操作方面,产品质量均一的优势,比如目前在临床三期的ARX788。

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ADC的偶联技术
图源:MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):46-53
06
毒素


ADC的毒素也需要满足很多特性。首先,由于ADC通常在水溶液中制备并经静脉给药,因此毒素分子需要有较好的稳定性。第二,毒素的活性最好能达到皮摩尔级别,即常规化疗药物的100–1000倍,因为最终只有一小部分ADC到达肿瘤细胞。第三,依赖溶酶体释放的毒素需要耐低pH,否则在到达效应部位之前就已失效。

目前细胞毒素大致分为澳瑞他汀、美登素、卡奇霉素,以及不太常用的duocarymycins和PBD二聚体。前两种都是通过干扰细胞周期来抑制细胞分裂,其中澳瑞他汀(如MMAE、MMAF)通过抑制微管蛋白上的GTP转化为GDP,导致微管的过度生长;美登素(如DM1、DM4)则是通过结合微管的生长端,阻止微管的成熟,最终影响细胞的分裂。


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Auristatins和maytansines作用于微管蛋白
图源:Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225


而卡奇霉素、duocarymycins和PBD二聚体则会导致DNA损伤。这些毒素分子最终都会诱导凋亡导致癌细胞死亡。

ADC药物分子设计的基本考虑   第9张

Calicheamicins损伤DNA的机制
图源:Toxins (Basel). 2011 Jul;3(7):848-883
07
展望


历经几十年,ADC已经有了巨大的发展,但它依然面临着不小的挑战。一方面导致ADC疗效不够的因素很多,另一方面ADC对正常细胞的伤害依然无法完全避免。组成ADC的三个主要部件都会影响它的疗效和副作用,如何同时优化三者达到最佳效果,目前还是一个难题。

尽管在设计上存在挑战,ADC还是为癌症疗法提供了新的思路,并有望成为未来精准医疗的重要组成部分。

参考文献

1.Peters C, Brown S. Antibody-drug conjugates as novel anti-cancer chemotherapeutics. Biosci Rep. 2015 Jun 12;35(4):e00225. doi: 10.1042/BSR20150089.

2.LoRusso PM, Weiss D, Guardino E, Girish S, Sliwkowski MX. Trastuzumab emtansine: a unique antibody-drug conjugate in development for human epidermal growth factor receptor 2-positive cancer. Clin Cancer Res. 2011 Oct 15;17(20):6437-47. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-11-0762.

3.Behrens CR, Liu B. Methods for site-specific drug conjugation to antibodies. MAbs. 2014 Jan-Feb;6(1):46-53. doi: 10.4161/mabs.26632.

4.Dosio F, Brusa P, Cattel L. Immunotoxins and anticancer drug conjugate assemblies: the role of the linkage between components. Toxins (Basel). 2011 Jul;3(7):848-83. doi: 10.3390/toxins3070848.

5.Zheng Su, Dian Xiao, Fei Xie, Lianqi Liu, Yanming Wang, Shiyong Fan, Xinbo Zhou, Song Li, Antibody–drug conjugates: Recent advances in linker chemistry, Acta Pharmaceutica Sinica B, 2021, 2211-3835

标签: ADC

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