细胞的真空吸尘器--如何克服P-gp造成的麻烦？

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令人伤心的是，我们经常会看到下面这种情况。

癌症患者最初对化疗反应很好。几个月后，这种药物就不再起作用了。

为什么呢？

虽然可能导致耐药性的因素很多，但最常见的原因之一是一种蛋白质转运体将药物排出细胞，从而导致药物治疗不再有效。

细胞膜上的这个转运蛋白就是P-糖蛋白。

人体 P-糖蛋白就像一个“油性分子真空吸尘器”，因为这种膜蛋白“吸掉”穿过的脂质双层各种油脂分子（包括有益的药物）,并将其送回细胞外。

本文综述了P-糖蛋白的发现、作用机制以及在药物设计中的变迁。

P-糖蛋白的发现

秋水仙碱（1）目前主要用于治疗痛风，但在20世纪60年代是用于治疗癌症的化疗药物。秋水仙碱通过与微管蛋白结合从而抑制微管的形成而起作用。不幸的是，由于秋水仙碱（1）的长期服用导致细胞的渗透性逐渐降低，很快产生了耐药性。多伦多大学的Lang和同事们从中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中鉴定出秋水仙素（1）-抗性细胞系。¹

他们选择的对秋水仙碱（1）耐药的细胞也显示出对许多其他药物的交叉耐药性。1976年，通过表面标记方法，他们从耐药的中国仓鼠卵巢细胞膜中分离出一种分子量为170 kDa的含糖蛋白质。该蛋白是一种在野生型细胞中未观察到的多药外排泵。由于这种糖蛋白在具有药物通透性改变的突变细胞中的独特性，Ling将其命名为通透性糖蛋白，也称为P-糖蛋白、P-gp或多药耐药蛋白-1（MDR1）。2

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1976年发现P-gp后，Ling及其同事确定了P-gp的作用对三磷酸腺苷（ATP）的依赖性，并具有稳定的细胞半衰期、质膜定位、丰富的糖基化模式和广泛的磷酸化的特性。

1995年，秋水仙碱（1）的故事翻开了新的一章，在C-10位置引入苯氨基基团造成苯氨基秋水仙碱2的P-gp结合减少了五倍，从而显著降低了其P-gp诱导的可能性。3

到目前为止，因为它通常在肿瘤细胞中过度表达，P-gp已被广泛认为是造成肿瘤细胞多药耐药的根源。然而，这种蛋白质转运体也有有益功能，例如，存在于胎盘膜上的P-gp，可以保护生长中的胎儿免受有毒化学物质的伤害。一些人称P-糖蛋白为通用解毒剂。

这种蛋白质作为基本屏障和过度保护屏障的双重作用在血脑屏障中得到了很好的证明。在血脑屏障中，P-糖蛋白保护大脑免受血液中有害化学物质的伤害，同时也通过排除可能对严重脑疾病有用的治疗药物分子而让药物开发人员备受挫折。

因此，P-gp在开发中枢（神经系统）药物中至关重要，因为P-gp不断地将药物从血脑屏障中泵出。中枢神经系统药物必须克服P-gp问题，才能使足够的药物进入大脑。

P-gp是如何工作的？

市面上一半的药物是P-gp外排底物， P-gp能结合300多种化合物！P-gp的特点是它的结合口袋允许疏水和芳香相互作用，从而允许多种结构多样的内源性配体和药物从质膜被运输到细胞外，导致细胞内药物水平较低。

为什么P-gp能识别数百种不同的疏水性药物并将它们泵出细胞？

早在1973年，丹麦的Danø就提出化疗耐药机制是由于药物的外排，像“真空吸尘器”一样将药物从细胞中吸出去。⁴1976年Ling发现后，P-gp被鉴定为是一种存在于多药耐药癌细胞中过度表达的膜蛋白，该细胞主动地将膜包埋药物泵出。

从那时起，真空吸尘器假说就变得流行起来。人们普遍认为P-gp是一种“油性分子真空吸尘器”，可以将药物“吸”出细胞膜。该模型假设药物在细胞质水相中与P-gp相互作用，穿过脂质双层膜泵出，并直接释放到细胞外水相。

2009年，斯克里普斯研究所的Chang解析了有3.8-Å分辨率小鼠P-gp的结构，显示了一个朝向细胞质的大开口作为一个大的药物结合袋。⁵这更加进一步加强了真空吸尘器的假说的可信度。

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1992年，Gottesman和Higgins讨论了P-gp外排功能的“翻动-翻转”模型。⁶“翻动-翻转”模型假设药物首先翻转进入脂膜，然后与P-gp的跨膜部分相互作用，P-gp将药物从细胞质“翻动”到外。最近的实验数据似乎支持P-gp功能的“翻动-翻转”模型，即在翻转酶“翻转”药物后，翻动酶将药物转运出去。7

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2021，根据其X射线晶体结构，一个日本研究组提出了另一个假设，即P-gp采用ATP-依赖的“扭曲和挤压”机制来输出疏水性药物。8

随着我们对这一复杂过程的理解不断加深，我们将构建越来越好的模型来说明P-gp是如何发挥作用的。

般来说，如果有P-gp，那么也会发现CYP3A4存在。这大概是由于人体采取了协同一致的策略来消除外源性物质。P-gp泵出尽可能多的外源物质，CYP3A去除剩余的。这被称为“外排代谢联盟”。

P-gp外排底物、抑制剂和诱导剂

莎士比亚说：“名字算什么呢？，我们无论如何称呼玫瑰，闻起来都是一样的甜。”他提醒我们不要太担心名字，但在科学领域，命名必须要搞清楚。

P-gp属于一类ATP结合型转运蛋白。大致而言，如果一个药物的输出量大于进入量，那么药物就是P-gp外排基质。基本上，P-gp底物被定义为由P-gp运输的化合物。如果P-gp流出比[ER= Papp_app(B_→_A)/Papp_app(A_→_B)] > 1.5，则药物为P-gp外排底物（此处，B = 基底外侧；a = 顶端）。

如果ER高于2.5，则认为流出比较高。实验上，如果添加环孢菌素A后细胞毒性增加 > 4倍，则可将化合物定义为P-gp外排底物。9

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大多数P-gp外排底物在性质上倾向于两亲性，结构上分别有疏水和亲水部分。Petrauskas及其同事通过对现有药物的广泛调查，提出了一个关于P-gp外排底物的4规则。¹⁰它指出，如果化合物：

N + O ≥ 8;

MW > 400; 而且

pKa > 4.

表明这种化合物更可能是P-gp外排底物。

相反，如果化合物：

N + O ≤ 8;

MW > 400; and

pKa < 8 (acids and neutrals).

表明这种化合物更可能不是P-gp外排底物。

P-gp外排底物的实例包括钙通道阻滞剂，如硝苯地平（3）; 以及环孢素、红霉素、洛哌丁胺、塔利诺尔、蛋白酶抑制剂，如HIV蛋白酶抑制剂利托那韦（4）; 还有因子Xa抑制剂阿哌沙班（5）、酪氨酸激酶抑制剂，如达沙替尼（6）和他克莫司。FDA将敏感的P-gp外排底物地高辛、非索非那定和达比加群酯列为临床药物相互作用研究中使用的P-gp的临床底物。

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人们已经观察到与P-gp外排底物地高辛有关的最显著的药物相互作用，当联合使用利托那韦（4）和雷诺嗪等P-gp抑制剂时，地高辛暴露显著增加（> 60%）。

P-gp抑制剂是抑制P-gp的化合物。实验上，如果外排抑制使罗丹明积累增加4倍，则这些药物为P-gp抑制剂/拮抗剂。¹⁰联合使用一种有效且选择性的P-gp抑制剂，该抑制剂不会引起细胞毒性作用，并且可以作为逆转P-gp外排底物的药物的外排作用非常有用。

第一代P-gp抑制剂包括维拉帕米（7）、三氟拉嗪（8）、环孢素A（9）等。它们具有低亲和力和低转运体选择性，并且在有效抑制P-gp的剂量时存在高毒性。Valspodar（10）、右维拉帕米（11）和biricodar（12）代表第二代P-gp抑制剂。它们具有较高的效价和P-gp选择性，毒性较低；然而，它们也显著抑制某些细胞色素P450酶，从而在临床应用上增加了造成药物-药物相互作用的可能性的问题。

第三代P-gp抑制剂的效力和特异性进一步提高，它们对某些细胞色素P450的亲和力可以忽略不计。它们包括zosuquidar（13）、tariquidar（14）、laniquidar（15）等。当它们与药物联合使用，可以克服其P-gp外排效应和耐药性。¹¹^–¹⁴

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一些化合物表现为P-gp诱导剂，降低总生物利用度，对肾脏清除率影响较小。利福平是最有效的P-gp诱导剂，导致底物暴露平均减少20%至67%。对于其他诱导剂，P-gp底物暴露的减少范围为12%至42%。

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规避P-gp以克服多药耐药性

有许多策略可以避免P-gp泵出效应以克服多药耐药性。它们包括纳米颗粒药物输送系统；利用microRNA调控P-gp；使用抗P-gp的单克隆抗体；和联合使用P-gp抑制剂；但作为一名药物化学家，我更喜欢将药物本身改为非P-gp外排基质，从根本上解决问题。实验上，Caco-2渗透性测定是一种流行的细胞方法。Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞通透性测定也经常使用。

减少P-gp外排的方法可分为两大类。

（1）降低氢键形成的能力。这可以通过消除氢键基团来实现，例如，使用没有氢键潜力的酰胺生物同构体；利用分子内氢键降低氢键电位；通过连接一个大的基团，给氢键供体原子引入空间位阻；通过添加相邻的吸电子基团来降低氢键受体电势；使氮原子甲基化等；

（2）通过结构修饰以干扰与P-gp的结合，例如添加强酸；减少杂原子数；以及降低log P以减少在脂质双层中与P-gp的结合并减少透过脂质双分子层。

4.1 降低氢键形成的能力

氢键的数量和强度对P-gp的结合有着深远的影响。氢键较少且较弱的化合物不太可能成为P-gp外排底物。

吡唑并吡啶16是电压门控钙通道的一个辅助a2d1亚单位药物抑制剂，也是众所周知的加巴喷丁和普瑞巴林的靶点。不幸的是，带有游离胺的16在过度表达P-gp的MDCK-MDR1细胞单层中出现P-gp泵出，ER的双向转运率为29。带有3-甲氧基吡咯烷取代基的吡唑并吡啶17的ER值较低，为1.8，其通透性显著改善。

这种改善主要是由于消除了作为氢键供体的伯胺。微小的修饰产生吡唑并吡啶18，不再是P-gp外排底物。16

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联苯19是一种相当有效的缓激肽B1受体拮抗剂，但其P-gp定向转运体比率较高（如果ER高于2.5，则认为其较高）。有人尝试降低酰胺基氧的氢键接受电位。一个强吸电子基团（–CF2CF3）被用以取代甲基，削弱了氧的氢键接受强度。事实上，该系列化合物20显示出可接受的P-gp比率和大鼠药代动力学曲线。17

药物的分子内氢键更容易在水中形成，因为从熵的角度考虑这更有利。分子内氢键常常促进细胞膜的渗透。例如，二肽21和22具有相同的分子量和PSA，而二肽22[P_app(A→B) = 43 nm/s]通过分子内氢键和较低的pKa，使得它的通透性是21[P_app(A→B) = 117 nm/s]的四倍。

本质上，分子内氢键有效中和了一个供体（氨基甲酸酯NH）和一个受体（吡啶基N）。因此，二肽22不再是P-gp外排底物。18

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日本筑波的一个研究小组发现硫醚23是一种有效的选择性阿片相关（ORL1）受体拮抗剂。它表现出明显的脑部暴露量低下，因为23是人类P-gp外排底物。作为系统结构-活性关系研究的一部分，就P-gp结合亲和力而言，可以用酮（24）取代硫醚键。酮24不是P-gp外排底物。引入的羰基和苯并咪唑NH之间的分子内氢键形成使得P-gp底物识别的显著降低。19

通过b-氟化调节胺的碱度可以克服P-gp细胞外排。驱动蛋白纺锤体蛋白（KSP）抑制剂已被用作抗有丝分裂剂。在一对配对的二氢吡咯25和26中，a-C2氨丙基侧链上的二氟甲基取代不仅减少了P-gp的外排，而且使被动透过性增加了近10倍。b-氟化使胺的pKa从10.3降低到7.0，logp从1.2增加到3.2，这与被动扩散的增加一致。

在这种情况下，氢键的数量和tPSA都没有改变；然而，预测的胺的氢键接受强度下降了6.9倍，分别为26和25。氢键接受强度的变化也与被动磁导率的变化一致。预计这些氢键效应在静电相互作用可能占主导地位的离子形式化合物时作用会小一些。20

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4.2 修改结构特征以干扰与P-gp的结合

增加空间位阻已被证明可以缓解P-gp问题。

四环化合物27是一种化疗药物，由于是P-gp底物，因此具有细胞毒性耐药性。27的曼尼希反应分别提供相应的3-氨基甲基衍生物28和29。这一操作赋予了由此产生的两种化合物一个显著的特征，即肿瘤细胞对多种抗癌药物具有抗药性。环胺哌嗪和奎宁在28和29上的空间位阻可能使相邻的酚基基团的氢键供体电位最小化。21

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甲基化酰胺或磺酰胺和减少杂原子数也被证明可以缓解P-gp问题。

葛兰素史克公司发现一种早期先导化合物磺酰胺30是2-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸（AMPA）受体的正变构调节剂。磺胺30具有良好的体外效价、效力、选择性和适度的血浆蛋白结合。使用表达人MDR1的MDCK细胞系对30进行的体外试验表明，尽管30具有良好的被动通透性，但30是人体细胞的底物（ER = 5.8）。

芳基磺酰胺基团的N-甲基化产生磺酰胺31，AMPA效价和效力变化最小，并具有降低P-gp外排率的预期效果（ER = 3.2）。在对各种取代基进行研究后，发现用2-氟吡啶环取代苯环可提供足够的AMPA效力，从而产生化合物32，通过MDCK-MDR1测试表明该化合物不是P-gp底物（ER = 1.1）。22

关于改变化合物P-糖蛋白外排性质的结构修饰的额外策略，可参考Hitchcock曾做过的精彩综述。23

总结

● P-gp外排大量存在，对于中枢神经系统药物和癌症药物更是臭名昭著；

● P-gp外排泵的工作模型包括“真空吸尘器假说”和“翻动-翻转”模型；

● 规避P-gp外排的策略包括降低氢键形成的能力和修改药物的结构特征以干扰与P-gp的结合。

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