如何克服时间依赖性抑制（TDI）？

Time-dependent inhibition

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什么是TDI？

时间依赖性抑制（Time-dependent Inhibition ，TDI）是指对细胞色素蛋白-450（CYP450）的抑制会降低药物清除率并诱导毒性，如肝毒性、特异性药物毒性等。

对细胞色素蛋白的抑制可分为两类：

 

● 母体化合物的直接可逆性抑制;

 

● 涉及活性代谢物的TDI。

 

细胞色素蛋白的TDI也称为MBI，是对CYP450酶的有时间、浓度和辅因子NADPH依赖性的抑制。(NADPH = beta-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。TDI是一个动力学术语，表明化合物与酶预孵育后，对细胞色素蛋白酶活性的抑制增加。

TDI可分为三类：

 

● 可逆性抑制；

 

● 准不可逆抑制；

 

● 不可逆抑制。

 

 

1.1 可逆性抑制

比尼美替尼是一个选择性MEK1/2抑制剂，也是一个可逆性的对CYP1A2有时间依赖性的抑制剂，可导致肝损伤。 

 

众所周知，因为许多肿瘤药物的治疗窗较窄，CYP的可逆性或时间依赖性抑制剂会影响抗癌药物的代谢，从而导致临床生物利用度增加和潜在的毒性。

 

1.2 准不可逆抑制

关于准不可逆抑制，药物首先代谢为活性代谢物。然后所得代谢物通过与血红素的催化铁形成紧密的非共价键，产生紧密结合的准不可逆的代谢物–中间体复合物，抑制CYP酶的活性部位。虽然这些非共价键可以解离，但这种血红素–配体复合物在体内是稳定的。

 

1.3 不可逆抑制

不可逆失活是观察到DDI的最常见的原因之一，通常意味着通过对血红素P450脱辅基蛋白的烷基化，代谢物和酶之间形成共价键。

 

这种现象被称为“自杀抑制”，抑制剂通常被称为“自杀底物”，因为抑制剂被酶代谢为反应性代谢物，这些代谢物共价结合并不可逆地抑制相同酶的活性位点。

 

不可逆失活是比可逆抑制更严重的一类抑制，因为酶是永久性失活的。为了恢复酶的活性，需要从头合成。因此，仅在多次给药时观察到DDI。此外，即使灭活剂从体内清除后，不可逆抑制的作用仍可持续存在。CYP酶的浓度需要几天的时间才能恢复到正常水平。CYP酶在人体内的半衰期如下表所示。[1]

 

杨森的厄达非替尼（1）是一个不可逆抑制的例子，这是一种成纤维细胞生长因子受体的首创泛抑制剂。当使用利伐沙班作为探针底物时，它以时间、浓度和NADPH依赖性方式灭活CYP3A4和CYP3A5。在谷胱甘肽（GSH）捕获研究中，厄达非替尼 (1) 被CYP3A代谢环氧化为厄达非替尼–环氧化物2，后者可能被GSH攻击形成开环产物4。脱水后释放谷胱甘肽加合物5。同样，当与CYP3A酶共同孵育时，厄达非替尼 (1) 也经历了类似的过程，与CYP3A酶上半胱氨酸的巯基形成C–S键。共价结合的加合物使厄达非替尼 (1) 成为CYP3A4和CYP3A5的不可逆抑制剂。[2]

 

 

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如何识别TDI？

具有TDI的药物以时间、浓度和NADHP依赖性方式使CYP酶失活。通过用软和硬亲核试剂（谷胱甘肽、氰化钾和甲氧基胺）对肝微粒体中的反应性代谢物捕获筛选，可以探索评估反应性代谢物的形成。

 

以监测药物CYP3A4 TDI风险举例。CYP3A4与待测药物预孵育0或30分钟，然后测定CYP3A4代谢睾酮的活性。在该筛选试验中CYP3A4活性损失<30%的结果证明CYP3A4显著TDI的风险较低，而显示损失> 50%的化合物可能证明有CYP3A4的TDI。

 

日本住友的5-羟色胺再摄取抑制剂DSP-1053显示出对CYP1A2的强效TDI。谷胱甘肽和KCN捕获实验表明DSP-1053的亚胺离子是主要代谢中间体，与CYP1A2形成共价键，导致不可逆抑制。[3]

 

 

此外，通常使用TDI动力学参数、最大灭活率（kinact）、半kinact浓度（KI）和kinact/KI比值进行风险评价。

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如何减低TDI？

文献中存在许多通过药物设计减弱TDI的策略。[4,5] 它们包括阻断代谢软点；调节亲脂性；使代谢位点定向；以及其他策略。

3.1 阻断代谢软点

 

阻断代谢软点是减低TDI的常用策略。这可以通过增加空间位阻或直接阻断代谢位点（例如用氟原子）来实现。

 

长期以来，β-分泌酶-1（BACE1）抑制剂一直被作为阿尔茨海默病的潜在治疗药物。默克的BACE1抑制剂5-氟嘧啶6经口给药后可降低大鼠脑脊液中的β-淀粉样蛋白。不幸的是，在脱靶倾向中，化合物6显示出了CYP3A4 TDI。在构效关系（SAR）研究中，默克发现5-氟嘧啶6的4位和6位的替换可以改善TDI，化合物7就是例证。

 

令人满意的是，与其较温和的TDI一致，化合物7比化合物6有显著改善，具体而言，在2μM时未观察到对6β-羟基睾酮的抑制，相对于化合物6，10μM时的kobs降低（分别为0.022和0.069 min⁻¹）。从机制上讲，5-嘧啶部分很可能被CYP3A4氧化为相应的环氧化物，随后被巯基攻击形成不可逆的抑制剂。[6]

自分泌运动因子是一种循环酶，在血液中溶血磷脂酸类物质的产生中起主要作用。自分泌运动因子抑制剂已被作为肺部疾病的潜在治疗药物，尤其是特发性肺纤维化。Galapagos的先导化合物8是一个强效自分泌运动因子抑制剂，但在hERG自动膜片钳试验中其抑制hERG通道的IC₅₀为2.9μM，在人肝微粒体试验中显示有CYP3A4 TDI。当在咪唑并[1,2-a]吡啶骨架的6-号位置用碱性较弱的哌嗪环来转换哌啶环时，导致hERG抑制降低，同时对自分泌运动因子保持相似的效力。

 

然而，虽然hERG抑制可通过降低碱性来减轻，但在人肝微粒体的CYP3A4 TDI试验中仍为阳性。咪唑并[1,2-a]吡啶核心6-号位置取代的变化对CYP3A4 TDI无影响。咪唑并[1，2-a]吡啶核心本身令人满意的支架修饰导致发现临床候选药物GLPG1690 (9) ，仅仅加了一个甲基就可以阻断吡啶环的环氧化。GLPG1690 (9) 是一种首创的自分泌运动因子抑制剂，进入临床评价，用于治疗特发性肺纤维化。[7]

 

不幸的是，GLPG1690（9，通用名:齐立他司他）的I；II期临床试验于2021年因获益–风险比例不利而中止。 

 

基因泰克的鼠前病毒插入（PIM）激酶的抑制剂10存在严重的CYP3A4 TDI。在曲线下面积（AUC）位移稀释试验中，当睾酮用作CYP3A一个结合位点的探针底物时，10抑制CYP3A，TDI IC₅₀低于0.1μM，AUC位移为57.3%。咪达唑仑作为CYP3A第二个结合位点的探针底物时得到了相似的结果（IC₅₀<0.1 μM，AUC偏移55.6%）。基因泰克选择截短的类似物11作为模型分子，以尽量减少TDI风险。SAR研究得到无CYP3A4 TDI的甲基化类似物12。完整分子10的延伸产生PIM激酶抑制剂13，TDI可能性极小。[8]

3.2 调节亲脂性

 

虽然亲脂性和CYP抑制之间的联系不是很强，但亲脂性和代谢程度之间的联系更紧密。亲脂性的调节导致代谢和生物活化为反应性代谢物的速率降低。

 

信号转导和转录激活子6（STAT6）是白细胞介素-4信号通路中的重要转录因子，也是二型辅助性T-细胞免疫应答的关键调节因子。因此，STAT6可能是过敏性疾病（包括哮喘和特应性疾病）的极好的治疗靶点。Astallas的STAT6抑制剂吗啉14使CYP3A4活性呈时间依赖性降低。亲脂性降低导致哌嗪15的生成，而哌嗪15未显示TDI。[9]

 

激酶共济失调毛细血管扩张突变和rad3相关 (ATR) 是DNA损伤反应的关键调节因子，顶端激酶负责协调修复停滞复制叉（复制压力）和相关DNA双链断裂的细胞过程。已将ATR抑制剂作为抗癌药物进行了研究。阿斯利康的砜AZ20 (16) 是一种体内工具化合物，是一种强效选择性ATR抑制剂。但其水溶性较低，且CYP3A4 TDI导致DDI的风险较高。广泛的SAR使他们确定了无CYP3A4 TDI倾向的亚砜亚胺AZ6738 (17) 。[10]

顺便提一下，亚砜亚胺官能团作为一种有用的生物等排体在药物化学中越来越流行。

 

AZ6738 (17) ，通用名ceralasertib，目前正处于II期临床试验阶段。

3.3 转移代谢位点

 

或者，代谢可以转移到分子的其他地方，从而减弱TDI风险。

 

例如，基因泰克的PI3-激酶δ抑制剂18具有CYP3A4的强效TDI。据推测，吲哚部分的激活是通过环氧化和形成对醌亚胺，然后与CYP3A4蛋白发生反应。在哌嗪处未检测到代谢，但在19中通过将其转化为融合的吗啉–哌嗪，代谢定向到该部分，TDI显著降低。该策略可能受益于19代谢产物的亲脂性降低，因此不太可能发生代谢以形成吗啉代谢的活性中间体。[11]

3.4 其他

 

许多减弱CYP TDI风险的方法是实验的成果。正如路易斯·巴斯德教导我们的那样：在实验领域，机会总是青睐有准备的人。

 

细胞周期蛋白依赖性激酶8（CDK8）是一种致癌基因，属于细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶家族。CDK8抑制剂作为抗癌药物被研究。武田的CDK8抑制剂吗啉20显示CYP3A4 TDI。在人肝微粒体中预孵育60分钟后，仅剩余54%的CYP3A4酶。SAR的研究指出代谢软点位于右手吗啉环上。用二氟氮杂环丁烷取代吗啉环产生氮杂环丁烷21，对CYP3A4没有明显的时间依赖性抑制作用。[12]

默克的异恶唑22是mGluR2的强效正变构调节剂，也是CYP3A4的强效TDI（Ki = 540 nM，kinact = 0.064 min^–1）。这是一个很大的缺点，特别是由于22的氧化代谢主要由人肝微粒体中的CYP3A4酶介导。因此，默克认为临床DDI可能性较高，并中止了异恶唑22的进一步进展。

 

22的苯胺氮是TDI最可能的根本原因，可能是通过形成活性亚硝基代谢产物所致。值得庆幸的是，哌嗪23不仅显著缓解CYP3A4 TDI，而且体外效力高于22。化合物（23）在大鼠和犬中的半衰期均延长（分别为10和16 h），这主要是由于通过提高血浆蛋白结合来促进代谢保护。[13]

 

诺华的强效C-RAF抑制剂24具有较高的TDI风险 (kobs > 0.03) 。据推测，该问题与嵌入这个化合物中的富含电子的双氨基吡啶官能团相关。为了降低电子密度，诺华将氨基乙醇侧链变更了为乙二醇侧链（用氧替代氮）。该策略发现了LXH254 (25) ，其保持了关键的F595氢键，非但CYP3A4 TDI的风险较低（kobs = 0.01），ADME特性和良好的细胞效力也达到了最佳平衡。[14]

 

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总结

 

● TDI可能是严重毒性的根本原因。

 

● 减低TDI的策略包括阻断代谢软点；调节亲脂性；重新定向代谢位点等。

 

● 然而，很多具有TDI但成功上市药物的存在提醒我们: 药物的效益–风险比的重要性。

 

参考文献

1. (a) Yang J, Liao M, Shou M, Jamei M, Yeo KR, Tucker GT, and Rostami-Hodjegan A (2008). Cytochrome P450 turnover: regulation of synthesis and degradation, methods for determining rates, and implications for the prediction of drug interactions. Curr Drug Metab 9:384 –394. (b) The Conduct of in Vitro Studies to Address Time-Dependent Inhibition of Drug-Metabolizing Enzymes: A Perspective of the Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. By: Grimm, Scott W.; Einolf, Heidi J.; Hall, Steven D.; He, Kan; Lim, Heng-Keang; Ling, Kah-Hiing John; Lu, Chuang; Nomeir, Amin A.; Seibert, Eleanore; Skordos, Konstantine W.; et al. Drug Metabolism and Disposition (2009), 37(7), 1355-1370.

2. Mechanism-Based Inactivation of Cytochrome P450 3A4 and 3A5 by the Fibroblast Growth Factor Receptor Inhibitor Erdafitinib.  Tang, Lloyd Wei Tat; Teng, Jian Wei; Koh, Siew Kwan; Zhou, Lei; Go, Mei Lin; Chan, Eric Chun Yong. Chemical Research in Toxicology (2021), 34(7), 1800-1813.

3. Time-dependent inhibition (TDI) of CYP1A2 by a CYP3A4-mediated reactive metabolite: proposal for a novel mechanism of irreversible TDI by a non-suicide substrate. By: Nishimuta, Haruka; Sato, Kimihiko; Watanabe, Takao; Yabuki, Masashi. Xenobiotica (2019), 49(6), 636-645.

4. Mechanism-Based Inactivation (MBI) of Cytochrome P450 Enzymes: Structure-Activity Relationships and Discovery Strategies To Mitigate Drug-Drug Interaction Risks. By: Orr, Suvi T. M.; Ripp, Sharon L.; Ballard, T. Eric; Henderson, Jaclyn L.; Scott, Dennis O.; Obach, R. Scott; Sun, Hao; Kalgutkar, Amit S. Journal of Medicinal Chemistry (2012), 55(11), 4896-4933.

5. Leach, Andrew G. Tactics to Avoid Inhibition of Cytochrome P450s. In Topics in Medicinal Chemistry (2015), 9, 107-158.

6. Overcoming Time-Dependent Inhibition (TDI) of Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) Resulting from Bioactivation of a Fluoropyrimidine Moiety. Mandal, Mihirbaran; Mitra, Kaushik; Grotz, Diane; Lin, Xinjie; Palamanda, Jairam; Kumari, Pramila; Buevich, Alexei; Caldwell, John P.; Chen, Xia; Cox, Kathleen; et al. Journal of Medicinal Chemistry (2018), 61(23), 10700-10708.

7. Discovery of 2‑[[2-Ethyl-6-[4-[2-(3-hydroxyazetidin-1-yl)-2-oxoethyl]piperazin-1-yl]-8-methylimidazo[1,2‑a]pyridin-3-yl]methylamino]-4-(4-fluorophenyl)thiazole-5-carbonitrile(GLPG1690), a First-in-Class Autotaxin Inhibitor Undergoing Clinical Evaluation for the Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Desroy, Nicolas; Housseman, Christopher; Bock, Xavier; Joncour, Agnes; Bienvenu, Natacha; Cherel, Laetitia; Labeguere, Virginie; Rondet, Emilie; Peixoto, Christophe; Grassot, Jean-Marie; et al. Journal of Medicinal Chemistry (2017), 60(9), 3580-3590.  

8. Probing Mechanisms of CYP3A Time-Dependent Inhibition Using a Truncated Model System. By: Wang, Xiaojing; Sun, Minghua; New, Connie; Nam, Spencer; Blackaby, Wesley P.; Hodges, Alastair J.; Nash, David; Matteucci, Mizio; Lyssikatos, Joseph P.; Fan, Peter W.; et al. ACS Medicinal Chemistry Letters (2015), 6(8), 925-929.

9. Nagashima S, Hondo T, Nagata H, Ogiyama T, Maeda J, Hoshii H et al (2009) Novel 7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine derivatives as potent and orally active STAT6 inhibitors. Bioorg Med Chem 17(19):6926–6936.

10. Discovery and Characterization of AZD6738, a Potent Inhibitor of Ataxia Telangiectasia Mutated and Rad3 Related (ATR) Kinase with Application as an Anticancer Agent. Foote, Kevin M.; Nissink, J. Willem M.; McGuire, Thomas; Turner, Paul; Guichard, Sylvie; Yates, James W. T.; Lau, Alan; Blades, Kevin; Heathcote, Dan; Odedra, Rajesh; et al. Journal of Medicinal Chemistry (2018), 61(22), 9889-9907

11. Safina BS, Baker S, Baumgardner M, Blaney PM, Chan BK, Chen YH et al (2012 Jun 28) Discovery of novel PI3-kinase delta specific inhibitors for the treatment of rheumatoid arthritis: taming CYP3A4 time-dependent inhibition. J Med Chem 55(12):5887–5900.

12. Studies of CDK 8/19 inhibitors: Discovery of novel and selective CDK8/19 dual inhibitors and elimination of their CYP3A4 time-dependent inhibition potential. Fujimoto, Jun; Hirayama, Takaharu; Hirata, Yasuhiro; Hikichi, Yukiko; Murai, Saomi; Hasegawa, Maki; Hasegawa, Yuka; Yonemori, Kazuko; Hata, Akito; Aoyama, Kazunobu; et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry (2017), 25(12), 3018-3033.

13. Optimization of Novel Aza-benzimidazolone mGluR2 PAMs with Respect to LLE and PK Properties and Mitigation of CYP TDI. Pero, Joseph E.; Rossi, Michael A.; Kelly, Michael J.; Lehman, Hannah D. G. F.; Layton, Mark E.; Garbaccio, Robert M.; O'Brien, Julie A.; Magliaro, Brian C.; Uslaner, Jason M.; Huszar, Sarah L.; et al. ACS Medicinal Chemistry Letters (2016), 7(3), 312-317.

14. Design and Discovery of N-(3-(2-(2-Hydroxyethoxy)-6-morpholinopyridin-4-yl)-4-methylphenyl)-2-(trifluoromethyl)isonicotinamide, a Selective, Efficacious, and Well-Tolerated RAF Inhibitor Targeting RAS Mutant Cancers: The Path to the Clinic. Ramurthy, Savithri; Taft, Benjamin R.; Aversa, Robert J.; Barsanti, Paul A.; Burger, Matthew T.; Lou, Yan; Nishiguchi, Gisele A.; Rico, Alice; Setti, Lina; Smith, Aaron; et al. Journal of Medicinal Chemistry (2020), 63(5), 2013-2027.