IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?

chem 74176 0

IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?  第1张

在酶学水平上对小分子抑制剂进行生物活性的定量测定相信是很多药物化学、化学生物学和生物学专业的同行们经常会遇到的问题。这个问题说难其实也不难,实验操作一般很简单,得到结果很容易;然而说简单也不尽然,比如很多人未必对于题目当中列出的IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff等概念都分得清,实验背后涉及到的米氏方程适用范围

在解释之前先放一张酶学反应式的图,方便后文的说明:


IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?  第2张


注:E=enzyme; S=substrate;ES=transition state complex of E and S; P=product; I,I’=inhibitor;EI,EI’=complex of enzyme and inhibitor; kx=corresponding reaction
rate constant; [X]=concentration of X


一、 定义


1) IC50(half maximal inhibitory concentration)

EC50(half maximal effective concentration)

广义的讲,IC50是对指定的生物过程(或该过程中的某个组分比如酶、受体、细胞等)抑制一半时所需的药物或者抑制剂的浓度。药学中用于表征拮抗剂(antagonist)在体外实验(in vitro)中的拮抗能力。EC50是指在特定暴露时间后,能达到50%最大生物效应对应的药物、抗体或者毒素等的浓度。药学中除了用于表征体外实验中(in vitro)激动剂(agonist)的激活能力外,还可用于表示达到体内(in vivo)最大生物效应一半时所需的血药浓度。在很多文献中,EC50也用于表征某化合物在细胞水平的效力(包括激动和拮抗)

2) Ki

抑制常数(inhibition constant),反映的是抑制剂对靶标的抑制强度,这个值越小说明抑制能力越强,某些情况下可以与后文的Kd等同。


IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?  第3张


Ki为50%的酶E被抑制剂I结合时对应的游离抑制剂的浓度。

3) Kd

解离常数(dissociation constant),反映的是化合物对靶标的亲和力大小,值越小亲和力越强。


IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?  第4张


从此公式得出:Kd为50%的酶E被抑制剂I’结合时对应的游离抑制剂的浓度。

4) Ka

结合常数(association constant),与Kd相反,值越大亲和力越强。


IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?  第5张


5) Km

米氏常数(Michaelis-Menten constant),为酶本身的一种特征参数,其物理意义为当酶促反应达到最大反应速度一半时底物S的浓度。Km的大小只与酶的性质有关,而与酶的浓度无关,但是随着测定的底物不同、温度、离子强度和pH的不同而不同。


IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?  第6张


只有当k2>>k3时,Km才近似等于ES的解离常数(Kd)。

6) Kon

结合速率常数(association rate constant),代表分子间结合时的快慢,单位为M-1∙S-1,与结合常数Ka (association constant)一词之差,差别却很大。

7) Koff

解离速率常数(dissociation rate constant),代表分子间解离时的快慢,单位为S-1,与解离常数Kd (dissociation constant)一词之差,差别却很大。【注:在SPR实验中,Kon和Koff 通常是以Ka和Kd给出的,而算出来的Kd和Ka它们又通常用KD和KA表示,注意这只是它们软件自己的标注方法,千万不要与标准的定义搞混了。个人觉得正是它们这种随便自己命名常数表示形式的做法,才导致很多小伙伴们看到这些概念时越来越混淆,害人不浅】


二、 区别


1) IC50和EC50

前面的定义部分其实已经说的很明白了,这里简单总结下使用范围:

IC50:只表征体外(in vitro)实验中拮抗剂(antagonist)的效力,但一般不包括细胞水平的数据表征。

EC50:可表示体外(in vitro)或体内(in vivo)数据:体外数据一般是细胞水平激动或者拮抗表征,以及激动剂的酶学水平数据表征;体内数据一般是动物水平。

2) IC50和Ki

从定义上能很明显地看出两者的区别,虽然两者都是表征化合物对靶标亲和力的指标,但是IC50与实验中所用酶的浓度、底物浓度都有关,而Ki是不受这些变量的影响的。目前很多药物化学文献中都不标注自己酶活实验所用酶和底物的浓度,直接给出IC50数据,其实这不利于不同文献之间化合物抑制能力的比较,因为IC50大小是可以通过酶和底物浓度进行调节的。从这个角度上来说,Ki才是更加准确的衡量指标,但是为何大多数文献都不用呢?这主要是由于Ki的测定过程稍繁琐。我们知道IC50的测定只需要拉出抑制剂浓度梯度进行生长曲线拟合即可方便地得出。然而Ki的测定需要先测定该酶特定条件下的Km,然后在某种抑制剂浓度、不同底物浓度下进行双倒数作图,得到表观Km(即Kmapp)后再根据Kmapp=Km(1+[I]/Ki)得到Ki,不过在竞争性抑制剂情况下,固定酶的浓度,IC50与Ki满足Cheng-Prusoff方程[3](注:此方程不适用于tight-binding型抑制剂,对于这种抑制剂其IC50与酶浓度相关):


IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?  第7张


也需要预先知道酶的Km值。

3) Ki和Kd、Km

先说Ki和Kd

前面提到过Ki和Kd在某些情况下是等同的。使用范围上:除了一些激动剂我们不用Ki表示其亲和力外(一般用Kd),拮抗剂用Ki和Kd表示其对靶标的亲和力均可。但是只有当无其他物质与该抑制剂进行竞争性结合时我们才能将Ki与Kd划等号。很容易发现,我们前面提到过的Ki都是在有底物S存在条件下进行竞争性生化实验测得的,而Kd都是单独的抑制剂与靶标蛋白结合过程测定的,两者的表达式都是:


IC50、EC50、Ki、Kd、Ka、Km、Kon、Koff傻傻分不清?  第8张


可见唯一不同的就是Ki测定时多了底物的竞争,而根据Ki定义,总酶量一定时,若想达到50%的酶E被抑制剂I结合,必定比无底物S竞争时需要的总抑制剂I更多,那么游离抑制剂浓度也必然升高了,意即Ki升高了。不知大家读到这里有没有联想到什么?这是不是跟表观Km(Kmapp)定义几乎一样?没错,这就是抑制剂I在底物S存在下的表观Ki[4](类比于抑制剂存在时酶的Km就变成了表观Km,即Kmapp),所以true Ki其实是在无其他物质竞争性与靶标结合时该化合物对靶标的亲和力,即Kd,只有这时候我们才将Ki与Kd划等号。在我们的实际实验中,Ki一般是通过竞争性酶活实验确定的,而Kd一般是通过生物物理的手段(比如ITC、SPR等)确定的,这时候显然生化实验中测得的表观Ki(Kiapp)是无法与生物物理手段测得的实际Ki(或称Kd)进行等价的。

最后,加入Km进行讨论:

前面提到过Km与Kd也只能在特定条件下(即k2>>k3时)等价,而如何确定何时k2>>k3,这个笔者也在求证中,正如第一部分注释中提到的疑惑,或许竞争性抑制剂和反竞争性抑制剂条件下都是k2>>k3,但这难免有强行解释之嫌,未触及到这个问题的本质原因,欢迎大家在评论区一同探讨。【此问题已解决,见文末】

总结:true Ki/Km都是在无其他物质竞争性抑制条件下才能得到,有其他物质竞争性参与了则得到apparent Ki/Km值,我们可以将Kd视为true Ki,而Ki默认为 apparent Ki

究竟有多大?生化酶活实验得到的抑制常数和基于生物物理手段(如ITC、SPR等)得到的抑制常数究竟有何区别,能否等价?我们常用的参数IC50真的能很好的反映出抑制剂的实际抑制强度吗?小分子和蛋白的结合动力学与热力学的联系及其在药化中的作用?接下来我们就先从这些常见参数的定义说起,然后讨论一下一些容易混淆的参数之间的区别。注:非特别注明,本文涉及到抑制剂时只讨论常见的竞争性抑制剂。




发布评论 0条评论)

您需要 登录账户 后才能发表评论

还木有评论哦,快来抢沙发吧~