化学经纬
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苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL)

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苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第1张

图1:DEL合成及筛选概览


2018年10月,药明康德宣布其建立了一个包含8000亿个化合物的DEL库,其中800亿个分子对外免费开放。


那么,什么是DEL?这一研究方法有何优势和劣势?DEL技术的现状如何?


现在,让我们带着这些问题来了解DEL技术。



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什么是DEL?


DNA编码化合物库(DNA-encoded libraries,DELs)是一个与特定DNA序列共价连接的小分子化合物库,能够用于针对生物靶标进行高效筛选。通过对结合化合物的DNA序列进行扩增和测序,可以有效地识别该化合物。

正如DEL技术的创始人Sydney Brenner和Richard Lerner所说:“通过将遗传学和有机合成化学的多功能性相结合,我们已经将分析的范围扩大到那些本身不属于生物系统的化学物质。”DEL领域的发展也起始于这两位先驱者在1992年发表的研究内容。[1]

关于这一领域的工作也已经有很多优秀的综述被报道。[2–6]




2

DEL的常规组装过程


DEL的常规组装是通过一系列的DNA编码及组合化学来实现的。


1. 组装“头部”:通常,一个DEL的“头部”由一段短小的DNA序列+ 连接子 + 游离氨基或其他功能团构成;


2. 用“条形码”标记“头部”:不同序列的DNA链将作为识别不同DEL的“条形码”与“头部”相连接。含有 DNA “头部”的溶液与不同的 DNA 链一起添加到 96 孔板的各个孔中,在酶的作用下DNA条形码与“头部”相连接,被标记的“头部”通过乙醇沉淀从连接混合物中分离出来;


3. 合成砌块(BB)的连接:然后将干燥的细长“头部”溶解在反应溶液中,通常通过酰胺的缩合反应给不同的DNA条形码标记的“头部”分别连上对应的合成砌块,合成砌块通常连接在游离氨基上;


4. 反应循环:重复2-3步来丰富DEL库的多样性,大多数的DEL会经历3次这样的循环;


5. 附加标记:在最后一次循环修饰完成后,DEL可能会再增加 标记一个包含附加信息的“条形码”。


苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第2张

图2:DEL库的合成


当一个DEL准备好后,可以按照以下三个步骤进行基于亲和力的筛选:


1. DEL 中的化合物与蛋白质一起孵育,经由亲和力捕获和洗脱以富集化合物库;


2. 最终通过 PCR 扩增、测序和翻译(解卷积)捕获化合物的DNA条形码来识别被结合的小分子的结构


3. 选定的苗头化合物通过在 DNA 外重新合成,以确认其结合能力。


苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第3张

图3:DEL库的筛选



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DEL技术的优缺点


DEL 技术有很多优点,如:高通量、操作简便、样品需求量少、基于亲和力的强弱进行化合物筛选、成本低廉等等[8]。

高通量:传统的高通量筛选(HTS)单次可以对十万 ~ 百万 个化合物进行评价,而 DEL 技术通常单次可以评价 百万 ~ 十亿 个化合物;此外,DEL 技术的信息密度非常高,一个20 聚体可以编码数百万种可避免错误冗余的化合物;

操作简便:一个包含有数十亿种化合物的 DEL 可以存储在一个小容器中。此外,一个完整的筛选过程可以在十天内完成;

样品需求量少:对于DEL库中的化合物只需要很少的量即可针对目标蛋白进行亲和力的测试;在对于目标蛋白的需求量上,传统 HTS需要10 mg目标蛋白,DEL技术只需要~ 0.3 nmol 的目标蛋白( < 1 mg)。同时,理论上,即使是单个 DNA 分子也可以通过 PCR 扩增到可检测的量;

基于亲和力的强弱进行化合物筛选:由于DEL 技术对于化合物的筛选仅基于分子与目标蛋白亲和力的强弱,所以在筛选化合物时不需要依据蛋白质的特异性来设置不同的筛选方法;

成本低廉:创建和筛选包含 100 万个化合物的传统 HTS的成本在 0.4 到 20 亿美元之间(每个化合物约 1,100 美元),而拥有 8 亿个化合物的 DEL 技术花费在150,000 美元左右(约合每个化合物 0.0002 美元)。这一方面的优势使得小型公司和学术研究机构在筛选苗头化合物时会将DEL 技术作为一个很好的选择[9]。

尽管如此,DEL 技术仍有一些严重的局限性,包括:有限的反应类型、适用目标有限、非功能性筛选、假阳性等等。

有限的反应类型:关于DEL技术一个最普遍的缺陷就是,所采用的合成条件为了保证DNA标签的完整性而受到了很大的局限,这比常规的化合物库更加限制了有机合成的能力;

适用目标有限:DEL技术主要应用在可纯化和可溶性蛋白质上进行化合物的筛选,同时,这些蛋白质要么能够被标记,要么能够被固定在固相载体上。这种方法的局限性是:目标蛋白的特性可能会在标记或固定时发生改变;而有些目标蛋白是很难以可溶的形式来获得的,例如 GPCR 和离子通道等;还有一些目标蛋白在细胞环境之外缺乏生物学相关的三级结构;

非功能性筛选:在通过DEL技术做筛选时不能够进行细胞功能或生化方面的测试,只能展示化合物与目标蛋白的结合能力;

假阳性:由于PCR扩增结合高通量的DNA筛选的灵敏度极高,即使是少量的杂质或未反应的原料也可能被当做结合体而被检测到。因此DEL技术出现假阳性的概率很高。

意识到这些缺陷后,DEL技术领域正在努力地开展研究以克服这些缺点。

苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第4张
图4:DEL库筛选膜蛋白配体



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DEL技术的成功范例


4.1   RIP1激酶抑制剂

GSK是 DEL技术的先驱。他们至少有三种临床在研药物来自DEL技术筛选。

受体相互作用蛋白1(RIP1)激酶是肿瘤坏死因子 (TNF) 介导炎症和病理学的重要驱动因素。GSK最初通过对于 700 万种化合物的常规 HTS 未能得到具有开发可行性的类药化合物。该公司利用“均分和合并”策略得到了一个包含 77 亿个化合物的专有 DEL化合物库。通过对于这个库中的化合物与靶蛋白进行亲和力测试,筛选得到了一个高活性和高选择性的苗头化合物GSK’481 (1),活性为1.3 nM。分子中独特的苯并氧氮杂庚酮的母核结构明显不同于传统的激酶相互作用化合物。

作为一个未经优化的苗头化合物,GSK’481 (1)在大鼠中已经表现出了不错的口服暴露量。经过少量的优化就得到了GSK2982772 (2),活性高,选择性好(对超过450种激酶具有选择性),口服暴露量高,PK性质优异(在猕猴中的生物利用度为85%)。GSK2982772 (2)已于2017年开展针对炎症性疾病,如牛皮癣、类风湿性关节炎和溃疡性牛皮癣的IIa临床试验[10, 11]。

类似地,GSK3145095 (3)也是从GSK的这一DEL化合物库中衍生得到。GSK3145095 (3)能够特异性地与RIP1结合,并在阻断RIP1激酶依赖性细胞反应方面具有出色的活性。由于口服生物利用度高、活性好,GSK3145095 (3)正在针对胰腺癌和其他几种实体瘤开展临床I期试验 [11]。

苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第5张
图5:GSK RIP1激酶抑制剂发现过程


4.2   sHE抑制剂

与 DEL 技术筛选的大多数激酶靶标不同,可溶性环氧化物水解酶 (sHE), 正如名称中所示,是一种水解酶。它将脂溶性的环氧化物转化为其相应的二醇,是心脏保护和炎症(如慢性阻塞性肺病 (COPD))的靶标。

前期GSK进行了HTS和FBDD尝试,但没有得到有优化前景的苗头化合物。通过对含有8亿个分子的DEL化合物库进行筛选,初步得到了一个经由三个合成砌块组成的三嗪化合物4,其IC50为40 nM。之后经过苗头化合物到先导化合物(H2L)的优化得到了哌嗪化合物5,其活性和各项理化性质都得到了提升。更进一步的成药性质的优化(如溶解度和生物利用度的提升)得到了临床候选化合物GSK2256294 (6)

GSK2256294 (6)对于其他靶点具有高选择性,同时,血浆蛋白结合率较低(87.2%),大鼠和犬中生物利用度优异(分别为94%和100%)。目前,GSK2256294 (6)在临床I期中获得了积极结果,正在糖尿病人体内开展临床IIa的试验[12]。

苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第6张
图6:GSK sHE抑制剂发现过程

4.3   Autotaxin抑制剂

Autotaxin 是一种循环酶,在血液中溶血磷酸的产生至关重要。Autotaxin抑制剂的研发主要为了治疗肺部疾病,尤其是特发性肺纤维化。医药公司Galapagos NV的全球首个Autotaxin抑制剂ziritaxestat (GLPG1690, 7)已经进行到临床III期。但是由于未达到预期的临床获益率,该公司已于2021年暂停了这一临床研究。

X-Chem在对一个含有2.25亿个分子的DEL化合物库进行筛选后得到了一系列对Autotaxin有抑制活性的化合物。对这一系列化合物进行优化,得到了化合物X-165 (8),活性高,靶点选择性好,生物利用度优异。X-165 (8)与人Autotaxin蛋白的共晶结构显示,X-165 (8)具有新颖的结合模式,同时占据Autotaxin中的疏水口袋和活性位点旁边的一个通道。化合物8目前已经入临床I期,适应症为特发性肺纤维化[13]。

苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第7张

图7:X-Chem Autotaxin抑制剂发现过程


4.4   PAR2拮抗剂

传统的DEL筛选对可溶性蛋白靶标具有不错的反馈,但是对于诸如G蛋白偶联受体(GPCR)等这一系列的膜蛋白就比较具有挑战性。究其原因,很大一部分是由于这一类蛋白本身与细胞膜结合的天性使得其很难在固相载体上暴露出合适的结合位点。没有合适的结合位点,就难以产生特异性的相互作用。

蛋白酶激活受体 2 (PAR2) 是GPCR的一种,与癌症和炎症等多种疾病有关。X-Chem通过对多个DEL化合物库的筛选得到了PAR2拮抗剂AZ3451 (9)。有趣地是,AZ3451 (9)是与螺旋束外的较远的变构位点结合,这与使用传统 HTS 发现的配体具有不同的结合模式[14]。

苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第8张

图8:X-Chem PARP2拮抗剂发现过程



4.5   变构β受体阻滞剂

β2-肾上腺素受体也是GPCR的一种。市面上所有的β受体阻滞剂都是结合在蛋白的正构位点,而这一位点正是内源性配体(肾上腺素)所结合的地方。杜克大学的诺奖得主Lefkowitz利用DEL技术来筛选β2-肾上腺素受体的变构位点配体。借助于Nuevolution(被安进收购的一家丹麦公司)的DEL化合物库,Lefkowitz和组员对共包含了1.9亿个分子的三个化合物库进行了检索,得到了一个具有三肽结构的苗头化合物10

该化合物能够和β2-肾上腺素受体胞内域上的一个变构位点相结合。研究发现,化合物10能够固定β2-肾上腺素受体的一个非活化构象,而这正是负变构调节剂 (NAM) 的经典作用模式[15]。

虽然,三肽化合物10几乎不能口服吸收,但是它可以作为研发口服药物的一个良好的苗头化合物。通过对于另一个包含有5亿个分子的DEL化合物库进行结合力的筛选,Lefkowitz发现了一个具有磺酰胺结构的化合物11,而这一化合物是一个正向变构调节剂[16]。

Lefkowitz 的研究表明,针对 GPCR 靶点筛选小分子 DEL 化合物库可以促进发现具有特定变构效应的 GPCR 药物。

苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第9张
图9: 变构β受体阻滞剂的发现过程


4.6   DEL-PROTAC的联用


PROTACs作为针对靶标蛋白的降解技术已经受到了制药界越来越多的关注。对于这一技术的难点就在于如何将靶标蛋白与E3泛素连接酶配体连接起来。由于DEL技术在筛选化合物时依据的是化合物与靶蛋白亲和力的高低,非常适合用来筛选能与靶蛋白形成高亲和力的化合物,所以,DEL技术可以作为PROTAC中鉴定哪些化合物可以作为靶蛋白配体的有力手段。

X-Chem针对ERα 野生型和3个突变型筛选了1200 亿个 DNA 编码分子,分别在有或没有雌二醇存在的条件下测试其对于 ERα 的亲和力。这种筛选得到了一系列与靶蛋白有作用的化合物,如化合物 12。值得注意的是,所有筛选得到的化合物都包含有苯酚这一结构。筛选之后的再合成得到的化合物13对ERα表现出nM级别的结合、拮抗和降解的能力。

在化合物13上组装上连接链和E3泛素连接酶配体VHL后就能够得到对ERα具有nM降解能力的双特异性化合物14。在小鼠PDX模型中,该化合物能够抑制ER阳性的MCF7肿瘤细胞的生长。这项研究表明,通过 DEL 筛选和小范围的优化,有望得到新颖的双特异性降解剂的先导化合物[17]。

苗头化合物的获得之DNA编码化合物库(DEL) 第10张
图10:利用DEL筛选PROTAC



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总结


在传统的HTS无法得到理想的苗头化合物时,DEL技术可以作为一个有效的手段继续进行尝试;

DEL技术得到的苗头化合物可以通过简单的优化获得临床候选化合物;

尽管在以靶点为导向的先导化合物筛选方面已经积累了很多工作,但是DEL技术只能应用于性能良好的蛋白质靶点。在早期药物发现领域,HTS仍然是应用最多的方法。


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