用小分子靶向RNA：药物发现的前沿

辉瑞针对COVID的mRNA疫苗，重新点燃了我们将核糖核酸（RNA）作为治疗目标的热情。然而，用小分子来靶向RNA是非常具有挑战性的。

首先，RNA只有四个构建模块：腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U），后者取代了DNA上的胸腺嘧啶（T）。这使得药物的选择性成为一个几乎不可逾越的障碍。相比之下，蛋白质有22种天然氨基酸作为它们的组成部分，这解释了为什么大多数针对蛋白质的药物具有相对较好的选择性。

一个小插曲强调了RNA构建模块的稀缺。

COVID病毒是一种RNA病毒。大流行开始几个月后，一位印度科学家在知名杂志上发表了一篇论文，声称COVID病毒是SARS病毒与HIV病毒的整合。证据是什么？他将COVID病毒的基因组与HIV的基因组进行了比较，发现两种病毒的几个片段完全相同。这篇论文引起全世界的关注。

但是，由于RNA只有四个构件，人们可以在几乎所有RNA病毒上找到完全相同的片段。这就是那篇论文的情况，它在网上发表几周后被迅速撤回了。

除了上面显示的一级结构外，像蛋白质一样，RNA分子也有二级和三级结构，如下图所示。尽管它们是单链大分子，但当碱基配对导致隆起、环形和螺旋时，它们的二级结构就会成形。然后，三维折叠导致了RNA的三级结构，这对其稳定性和功能至关重要。

RNA有三种类型：mRNA、rRNA和tRNA。

• 信使RNA（mRNA）从DNA转录遗传信息，作为碱基序列被转移到核糖体上；

• 核糖体RNA（rRNA）是被称为核糖体的蛋白质合成细胞器的一部分，它被输出到细胞质中，帮助将mRNA中的信息翻译成蛋白质；

• 转移核糖核酸（tRNA）是mRNA和构成蛋白质的氨基酸链之间的纽带。

RNA作为治疗靶点实际上是非常有吸引力的。已经发现，我们的基因组中只有1.5%最终被翻译成蛋白质，而70%-90%被转录成RNA。RNA分子对所有生物都是最重要的。根据弗朗西斯·克里克的“中心法则”，RNA最关键的作用是将遗传信息从DNA翻译成蛋白质。但RNA分子也有其他功能，包括：

• 在蛋白质合成中作为适配器分子发挥作用；

• 充当DNA和核糖体之间的信使；

• 它们是所有活细胞中遗传信息的载体；

• 促进核糖体选择正确的氨基酸，这是在体内合成新蛋白质所需要的。

许多抗生素尽管早在20世纪40年代就被发现，但它们的作用机制直到80年代末才被搞定。我们发现，很大一部分抗生素通过与细菌核糖体结合来阻止它们制造适当的蛋白质, 从而杀死细菌。

例如，氨基糖苷类抗生素与构成细菌30S核糖体的16S rRNA的A-位点结合，随后通过阻止蛋白质合成干扰细菌生长，最终导致细胞死亡。A-位点是指氨基酰基位点，也被称为tRNA接受位点。与大肠杆菌RNA的A-位点结合的氨基糖苷类药物帕罗霉素，它们之间的详细相互作用显示如下。

遗憾的是，许多原核A-位点抑制剂，包括氨基糖苷类药物，都存在安全问题，如肾毒性、剂量依赖性和特异性的不可逆转的耳毒性。这些毒性是氨基糖苷类药物对RNA小分子识别缺乏选择性的结果。

如下图所示，（a）细菌、（b）人类的细胞膜、和（c）人类的线粒体A-位点的结构非常相似，足以让A-位点抑制剂与它们全部结合。

四环素类抗生素也抑制rRNA的A-位。它们与Mg²⁺复合物可逆地结合30S亚基上的一个螺旋区（H34），从而选择性地抑制细菌蛋白质的合成。

另一方面，大环内酯类抗生素在细菌核糖体出口位点（E-位点）附近的新生肽出口隧道（NPET）处结合，并部分封堵它，从而抑制细菌的蛋白质合成。

最后，噁唑烷酮类抗生素，如利奈唑胺（Zyvox），与细菌50S核糖体亚单位的一个深裂缝结合，该裂缝被23S rRNA核苷酸包围。

虽然市场上绝大多数传统药物的靶点是蛋白质，但反义药物靶点的是RNA。它们是经过化学修饰的核酸聚合物，依靠Watson-Crick碱基对与目标mRNA结合，导致基因沉默、立体阻碍、或替代剪接。

反义寡核苷酸（ASO）可以与细胞核中的pre-RNA和细胞质中的成熟mRNA相互作用。它们可以针对外显子、内隐子和非翻译区（UTR）位点。

Ionis的ASO药物米泊美森（Kynamro）能降低载脂蛋白B-100的水平，这种蛋白质是低密度脂蛋白（LDL）的主要成分。米泊美森针对载脂蛋白B-100的mRNA，导致低密度脂蛋白水平的降低。

为了增加其稳定性和亲和力，米泊美森上的一个磷酸P-O键被修改为P-S键。此外，核糖单元上的2′-OH被修饰为2′-O-MOE取代基。但是，米泊美森已经遇到了肝脏和心血管安全问题。尽管它是FDA批准的早期ASO药物之一，但它在商业上是失败的。

相比之下，Biogen/Ionis的ASO药物诺西那生钠（Spinaraza）则是一个重磅炸弹。该药于2016年被批准用于治疗一种罕见的遗传性疾病——脊髓性肌萎缩症（SMA），每名患者每年的费用几乎为100万美元。

SMA的主要病因是生存运动神经元（SMN）蛋白水平低，这是SMN1基因同源缺失或突变的结果。诺西那生钠调节SMN2基因的替代剪接，在功能上将其转化为SMN1基因，从而提高中枢神经系统中的SMN蛋白水平。

到目前为止，已经有十几种ASO药物获得了FDA的批准。

如上所述，SMN2基因的不正确剪接是SMA的根本原因。这个错误可以被诺西那生钠修正，但问题是诺西那生钠太贵了。如果一个小分子药物可以做同样的工作，这种疗法将更便宜。

诺华发现了这样一种小分子，即布拉纳普拉姆。2015年，诺华报告了他们发现的一种SMN2剪接调节剂布拉纳普拉姆，可以增强U1-pre-mRNA的关联，并拯救SMA小鼠。

先驱者并不总是在药物发现方面取得成功。不知道出于何种原因，诺华的布拉纳普拉姆从未进入市场。另一方面，PTC/罗氏的利司扑兰（Evrysdi）于2020年被FDA批准，用于治疗SMA。就像布拉纳普拉姆一样，利司扑兰也是通过调节相关SMN2基因的剪接来发挥作用，从而产生功能性SMN蛋白。

事实上，利司扑兰通过充当“分子胶”来改变剪接。它与U1 RNA和SMN2 pre-mRNA之间形成的RNA:RNA双链结合，从而稳定第7外显子的5′剪接位点和U1小核糖核酸蛋白（snRNP）之间的相互作用。最终的结果是，利司扑兰与SMN2 pre-mRNA相互作用，增强第7外显子的包容性，以增加功能性SMN蛋白的水平。

利司扑兰的成功，刺激了大约十几家生物技术公司的成立，它们致力于开发用小分子靶向RNA的平台。其中，比较有名的公司包括Arrakis、NextRNA Therapeutics、Sarepta Therapeutics、Skyhawk等。可以期待，更多以RNA为靶点的小分子药物将越过终点线，进入市场，帮助病人（身体健康）和创新公司（财务健康）。

早在2017年，人们发现几种老的抗癌磺胺类药物，如吲哚磺胺、E7820和CRS，通过招募到DCAF15诱导RBM39降解，从而使RNA切片发挥作用。

RBM代表RNA结合基序蛋白。从本质上讲，吲哚磺胺是一种分子胶。它选择性地将RBM39招募到CRL4-DCAF15 E3泛素连接酶，促进RBM39的多泛素化和蛋白体降解。RBM39的遗传耗竭或吲哚磺胺介导的降解，会诱发明显的全基因组剪接异常，最终导致细胞死亡。

RNA-PROTAC是为了降解RNA-结合蛋白（RBPs）而开发的。PROTAC使用一个连接物将E3配体酶配体与RNA连接起来，RNA与RBPs结合。因为RBP包含可以与特定的寡核苷酸序列结合的结构域，RNA-PROTAC利用寡核苷酸序列作为感兴趣的蛋白质（POI）配体。最终的结果，是RBPs的降解。

最近，斯克里普斯海洋研究所的迪斯尼教授发明了核糖核酸酶靶向嵌合体（RIBOTAC）。RIBOTAC是一个异质功能分子，用连接物连接核糖核酸酶配体和RNA配体。它能特异性地将内源性核糖核酸酶RNase L招募到特定的RNA靶点，然后利用细胞内核酸裂解机制（RNase L）成功消除RNA。

随着我们对小分子和RNA靶点之间的相互作用了解得越来越多，更多使用这种方式的药物将会出现。