碘加速鹅膏蕈碱类毒素的合成

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开发多肽类药物一直是药物研发的热点且极具挑战,多肽环化策略的发展加速了生物活性分子的发现和研究,尤其是其在蛋白-蛋白相互作用(PPI)领域的应用。在自然中,环化的非核糖体多肽(Nonribosomal peptides)具有多样性的生物活性,例如环孢菌素(Cyclosporine,免疫抑制剂)和万古霉素(Vancomycin,抗生素)。作为核糖体多肽类天然产物(RiPPs)、鹅膏蕈碱(amanitin)和鬼笔环肽(phalloidin)分别对真核细胞的RNA聚合酶和F-肌动蛋白表现出极强的抑制作用,所以具有广泛的生物学以及药理学的用途。最近,德国Heidelberg Pharma基于鹅膏蕈碱研发的抗体偶联药物HDP-101(图1)被FDA批准进入临床试验,用于治疗多发性骨髓瘤。作为首个RNA聚合酶抑制剂类的抗体偶联药物,鹅膏蕈碱的化学合成以及构效关系的研究亟待发展。

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图1. 抗体偶联药物HDP-101结构示意图


alpha鹅膏蕈碱是从毒蘑菇死亡帽中分离出来的双环八肽,其对大鼠的口服半数致死剂量(LD50)为50-100 µg/Kg。从结构来看,合成该类分子的主要挑战是如何构建6-OH-Trp 和Cys之间的tryptathionine桥键。2018年Perrin课题组利用分子内Savige-Fontana反应完成了该分子的首次全合成(图2a,J. Am. Chem. Soc.2018140, 6513–6517),合成步骤繁琐且最终产物只有微克级别。随后Heidelberg Pharma利用光氧化策略优化了该反应(图2b,Angew. Chem. Int. Ed.202059, 11390 –1139),实现了alpha 和beta 鹅膏蕈碱的合成。近期,柏林工业大学Roderich D. Süssmuth教授课题组开发了 [5+2+1] 碎片缩合的方法,在液相中完成了该分子的合成(图2c,Angew. Chem. Int. Ed., 202059, 5500 –5504),这为大规模制备打下了基础。但是迄今为止,所有的合成方法都需要预先制备正交保护的合成模块或者中间体,往往效率不高。

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图2. tryptathionine桥键合成。图片来源:JACS


2019年Süssmuth教授课题组将碘介导的tryptathionine合成策略成功应用在鬼笔环肽分子的全合成(Chem. Eur. J., 201925, 8030–8034),但意外的是还没有应用到鹅膏蕈碱类分子上。基于以上背景,Roderich D. Süssmuth课题组首先利用分子动力学模拟(MD simulation)和核磁共振溶液结构计算,阐明碘介导的方法不适用于大环内酰胺4(图3b-3d)。随后作者调整合成策略,以线性肽(6)为模型分子,碘介导的环化结果表明,该方法对包含“Gly-Ile-Gly”片段的线性肽6具有较强的选择性(图3g)。为了考察该反应的通用性,作者利用模型肽6,首先对不同的的卤素试剂进行筛选,结果表明除了NBS,其他的碘试剂(碘、NIS、I-Cl和I-Br)都表现出很高的转化效率。之后作者对不同类型化学溶剂进行了筛选,实验证明极性非质子溶剂具有良好的转化效率。在优化完实验条件后,作者设计合成了34个不同序列的多肽分子,研究了该反应的适用范围和局限性,结果表明:1)胺基以及酚羟基需要功能团保护,醇羟基(Thr和Ser)则并不需要;2)因为位阻影响,色氨酸的吲哚环不应保护;3)柔性多肽序列往往具有较高的反应性。

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图3. 碘介导的 tryptathionine桥键合成。图片来源:JACS


在对该方法进行了深入探索后,作者将目标集中在鹅膏蕈碱的全合成。首先根据碘介导的环化效率,确定大环内酰胺化的反应位点为(4,5)-二羟基-(4R,3R, 2S)-异亮氨酸(DHIle)和顺式-4-羟基脯氨酸(Hyp)之间。随后根据逆合成分析,利用不对称催化反应完成两个非天然氨基酸的合成,实现了对该分子的化学合成(图4)。在此基础上,作者设计合成了25个新颖的鹅膏毒素分子,对其构效关系(SAR)进行了全面的研究。之前的毒理学证实鹅膏蕈碱因为可以被阴离子转运蛋白(OATP1B3)转运至肝脏细胞,具有极强的肝脏毒性。为了寻找高效且低毒的前景分子,研究团队首先利用体外实验评估了目标分子对RNA聚合酶的抑制活性和细胞毒性,将正常HEK-239 和HEK-239-OATP1B3的细胞毒性实验进行比较,验证其类似物是否被OATP1B3转运。实验结果表明除7位的Gly位点可以改造,其余位点的耐受性极差。相比模板分子Ama-01(图4,6.8 nM),合成的Ama-15对RNA聚合酶的抑制活性增强了五倍(1.4 nM),但是其对人胚胎肾细胞的毒性明显减弱。

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图4. 逆合成分析和构效关系。图片来源:JACS


该研究成果为快速高效合成鹅膏蕈碱类毒素,寻找新型payload用来研究偶联药物铺平了道路,为多肽环化策略提供了新的思路。相关工作已经申请了国际专利,并发表在Journal of the American Chemical Society姚贵阳博士和博士生Caroline H. Knittel为该文共同第一作者,柏林工业大学Roderich D. Süssmuth教授为通讯作者,该工作是与柏林自由大学和Heidelberg Pharma合作完成,并得到洪堡基金会和DFG的支持。


J. Am. Chem. Soc., 2021, DOI: 10.1021/jacs.1c06565


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