溶液中的生物分子（例如蛋白质）不是静态的。实际上，它们是动态的，并且作为具有不同能量的构象集合而存在。根据自由能的不同，集合中的每个构象都具有特定的分布，而低能量构象较高能构象更容易被采样。然而，构象的分布是可调的，可以根据配体结合，点突变，共价修饰，压力和温度的改变而变化。这种构象集合的再分配是变构效应的“本质”。

变构效应或变构调节，被称为“生命的第二秘密”，调整了无数的生物过程，包括信号转导，酶促催化，代谢和转录。蛋白质变构失调与许多疾病（如癌症）的病因密切相关，如精神障碍，糖尿病和炎症等。因此，通过变构调节剂修复功能失调的蛋白质为创新疗法提供了发展前景。根据正构位点与变构位点空间和拓扑上的区别，变构位点的结构更具多样性，而变构调节剂具有更高选择性和更少副作用的独特优势。这些优势使得变构调节剂的设计在药物研究和开发中具有更重要的意义。

鉴于隐藏的变构位点在药物设计中的重要性，许多研究小组投入了大量人力物力来开发检测这些位点的方法。上海交通大学张健课题组发文“Discovery of hidden allosteric sites as novel targets for allosteric drug design” 于杂志Drug Discovery Today。在文章中作者总结了4种相关的计算方法。

理论上，蛋白质的大规模无偏差MD模拟可以对多种蛋白质构象进行采样。通过MD模拟采样的几个low-populated构象不能通过实验方法捕获。这些构象可能隐藏了变构点，可以在变构剂的设计中被应用。

G蛋白偶联受体（GPCR）是最大类别的药物靶标，约三分之一的标记药物能与GPCR结合。Dror, R.O等人以β2-肾上腺素能受体(β2AR)为例，进行了许多长时间无偏的MD模拟，其中几个β受体阻滞剂（propranolol、alprenolol和dihydroalprenolol）远离正位结合位点和受体表面。模拟显示药物分子以类似于晶体结构的姿势的方式自发地结合到β2AR的正构结合位点。然而，在β受体阻滞剂与β2AR结合过程中可以观察到胞外前庭中几个亚稳态隐藏的结合位点，其可以作为变构调节剂的靶标。人M2毒蕈碱型乙酰胆碱受体的晶体结构恰好揭示了这个相应的隐藏变构位点的存在，其中正变构调节剂LY2119620存在于胞外前庭中。

作为一个小的GTPase，K-Ras4B扮演为分子开关，在非活性的GDP结合和活性的GTP结合态之间切换。K-Ras4B可以调节多个信号通路，对细胞生长、增殖和分化至关重要。致癌突变引起的K-Ras4B的过度激活发生在各种癌症中，如肺癌和胰腺癌。然而，近30年的研究还没有发现靶向K-Ras4B的药物。

最近，Hocker, H.J等人应用GTP结合K-Ras4BQ61H MD轨迹的均方根偏差（RMSD）聚类方法，选出了75个独特的K-Ras4B构象异构体的集合。他们将穿心莲内酯（AGP）及其亚苄基衍生物（SRJ09，SRJ10和SRJ23）盲目对接到K-Ras4B 75个构象集合中。因为在已知的晶体结构中很难观察到这些K-Ras4B构象异构体，为了排除偏差，在整个K-Ras4B表面上进行盲目对接，没有指定口袋。对接结果定义了这些配体最常靶向的三个口袋，这些口袋与活性部位不重叠，可被视为隐藏在晶体结构中不可见的变构位点。为了进一步揭示配体结合的最大可能性，对在不同口袋中K-Ras4B与SRJ23复合物以不同的初始速度进行了多个MD模拟。结果表明SRJ23优先与口袋1结合。K-Ras4B-SRJ23轨迹的分析表明SRJ23与隐藏口袋1的结合变构促使K-Ras4B处于对GEF结合具有抗性的独特构象。基于体外细胞的测定证明，SRJ配体显着降低GTP与K-Ras4B的结合，并抑制癌细胞生长。

与常规MD模拟相比，加速MD（aMD）模拟能向势能面引入非负升压电位，能够促进蛋白质（尤其是具有慢时间动态的蛋白质）低能态之间的构象转变和构象取样的有效增强。

白细胞介素-1受体1（IL-1R1）是细胞因子家族中的重要成员，是治疗免疫依赖性疾病和炎症的靶标。它通过蛋白质-蛋白质相互作用与细胞因子结合，并可能会调节细胞因子的产生，从而导致免疫细胞的异常活化。然而，设计靶向IL-1R /细胞因子蛋白质-蛋白质界面的小分子抑制剂仍具有挑战性。Yang, C.Y等人基于IL-1R1胞外域的晶体结构进行aMD模拟，以对蛋白质的构象多样性进行采样，目的是确定独特构象中潜在的隐性变构位点。aMD轨迹中的代表构象被用于聚类分析，并使用Sitemap算法评估这些构象中的小分子结合位点。确定了位于D2和D3结构域之间的一个隐藏的变构位点。通过针对该位点的虚拟筛选鉴定了8种潜在的变构抑制剂。对8种变构抑制剂复合IL-1R1胞外域的MD模拟显示，其中4种变构抑制剂能够干扰预测的隐藏变构位点和活性位点之间的联系，从而将L-1R1胞外域限制在无活性状态。

从单个MD模拟中完全捕获生物分子的整体状态是具有挑战性的。而基于大量广泛的MD模拟构建的Markov状态模型（MSMs）可以为生物分子提供的原子级详细的缩小视图。这些模型的优点在于它们能够识别位于较小构象中的隐藏变构位点，而这些构象可以从多个模拟而不是单个模拟中捕获。

TEM-1 β-内酰胺酶能催化β-内酰胺抗生素（例如青霉素，碳青霉烯和头孢霉素）的水解，从而破坏β-内酰胺环，导致抗生素的抗菌性质失活，并且使细菌产生抗药性。X射线晶体学研究表明，抑制剂与TEM-1β-内酰胺酶的隐藏变构位点结合，该位点距活性位点较远（16 Å），在apo晶体结构中不可见（配体未结合的TEM-1 b-内酰胺酶）。基于1000次对apo TEM-1 b-内酰胺酶（PDB ID：1JWP）模拟，总模拟时间为81 ms，Bowman, G.R.等人用MSMBuilder进行MSMs构建并获得大约5000个状态。通过使用LIGSITE口袋检测算法，针对apo TEM-1 b-内酰胺酶的MSM中每个状态，获得与抑制剂结合的TEM-1 b-内酰胺酶晶体结构中已知的隐藏变构位点。除了这个已知的隐藏变构站点之外，还检测到了三个其他的隐藏位点。

隐藏变构位点的成功检测源于对蛋白质快速、有效的构象取样。实际上，构建一个易于使用的平台来检测隐藏的变构位点已经在进行中，它集成了正常模式分析（NMA）以快速采样蛋白质构象，并随后利用先前开发的Allosite服务器来预测变构。此外，Berezovsky等人最近开发的基于结构的通用统计机械模型，可以通过评估每个残基的变构自由能变化来预测变构位点，并且可以量化由变构位点的突变或配体结合诱导的变构信号传导的影响。总而言之，这些计算进步将使我们成为可能以更高的准确度预测隐藏的变构点。此外，最近在NMR光谱学中同位素标记和脉冲序列技术的突破可以帮助研究人员研究动力学和变构机制，并确定大蛋白系统中隐藏的变构位点。隐藏的变构位点的发现将极大扩展可用药物的靶标，为药物设计提供了一个新的途径，为变构药物发现提供了机会。

参考资料：

[1] Discovery of hidden allosteric sites as novel targets for allosteric drug design