PROTAC药物的代谢特征总结

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蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimera,PROTAC,下同)是一类新兴的治疗药物,因其扩展了可成药靶点的覆盖范围,并有潜力解决小分子抑制剂的耐药性问题,因此在生物医药领域的学术界、产业界和投资界均引起了广泛关注。2021年10月,Health and Environmental Sciences Institute (HESI)这一非盈利机构汇聚了超过150位药物科学家、监管者和学术研究人员,一同深度探讨了靶向蛋白降解剂的安全性评价等重要问题[1]。参会人士普遍认为,PROTAC的安全性挑战主要涉及脱靶蛋白降解、与传统小分子药物在药物动力学/药效学(PK/PD)上的差异,以及在非临床试验中选择合适的种属进行安全性评估。因此,我们亟需尽早深入研究PROTAC的代谢产物,这对于分析药物在人体循环中的分布、评估其安全性、对比不同种间的代谢差异以及选择合适的毒理学种属等至关重要。本文将以PROTAC的结构特征为出发点,探讨其代谢特征,旨在为制定合理的代谢产物研究策略奠定基础,同时为药物化学家设计具有良好药代动力学特性的PROTAC分子提供参考,并为PROTAC新药开发提供有效的指导。


1.PROTAC药物的结构特征

PROTAC药物以其独特的结构和作用机制带来了显著的治疗优势。然而,这种特殊的结构也赋予了它独特的理化性质以及与传统小分子药物不同的代谢特征。为了更深入地理解其代谢特征,我们将首先介绍PROTAC的结构特征,为总结和探讨其代谢特征奠定基础。PROTAC主要由三个关键结构组成:一侧分子区域是靶向目标蛋白(Protein of Interest,POI)的配体结构;另一侧分子区域是E3连接酶的配体结构;中间是连接这两个配体的连接子(linker)(图1)。下文将从结构特点出发,对这三个部分逐一介绍。

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图1. PROTAC结构示意图及代表性的PROTAC的结构ARV-110

1.1    POI配体

目前已报道的PROTAC分子中,POI配体的数量已超过360个[2]。作用的靶蛋白包括雄激素受体(AR),雌激素受体(ER),含溴结构域的蛋白(BRD),布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)等。PROTAC的POI配体部分一般选择上市或文献报道的活性抑制剂[3]。比如2019年Gray组基于CDK4/6抑制剂帕博西尼开发的BSJ-03-204[4],以及2021年卞金磊团队基于CDK9抑制剂BAY-1143572开发的B03[5]

PROTAC药物的作用靶点不仅包括常规小分子药物的靶点,还拓宽至不可成药蛋白、具有支架功能的蛋白、蛋白聚合体、具有耐药性的突变蛋白,以及特定的亚型蛋白等。如信号转导与转录激活因子3(STAT3)是一种与癌症的发生密切相关的转录因子,被认为是一种不可成药蛋白。王少萌组[6]基于STAT3中SH2结构域的结合剂SI-109,开发了PROTAC分子SD-63,该分子在体内外实验中对STAT3蛋白均有较高的降解活性(图2)。Kymera公司开发的KT-333同样是靶向STAT3的PROTAC药物,目前已进入I期临床,评估其在大颗粒淋巴细胞白血病患者中的安全性。

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图2. STAT3降解剂SD-63

1.2    E3连接酶配体

目前已知有600多种人类基因组编码的E3连接酶[2],但在药物设计领域与PROTAC相关的E3泛素连接酶主要有cereblon(CRBN,71种亚型)、von Hippel-Lindau(VHL,47种亚型)、细胞凋亡抑制蛋白(cIAP,7种亚型)和鼠双微体基因(MDM2,4种亚型)(图3)[3]。在目前已进入临床阶段并公布结构的PROTAC中连有CRBN配体的分子占比超过39%,含有VHL配体的PROTAC仅有DT2216

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图3.代表性E3连接酶配体

探索新型E3泛素连接酶靶点是PROTAC研究领域的热点课题之一。近年来,研究人员还发现了一些结构新颖的E3连接酶,包括DCAF11、DCAF15、DCAF16、RNF114、RNF4、AhR、FEM1B和KEAP1等,目前已报道的新型E3连接酶配体已超过80个[3],相信未来研究人员能找到更加多样化的E3连接酶以及分子量更小、活性更高的E3连接酶配体。

1.3    连接子(linker)

Linker是连接PROTAC药物两个活性基团的重要结构,对于PROTAC分子的活性、代谢稳定性和药代动力学特性有着至关重要的作用。

目前已报道超过1500种不同的linker结构[2],从分子可变性的角度,可将linker分为柔性和刚性两种类型(图4)。相关文献[7]表明,linker过短或过长均不利于PROTAC发挥药效。当linker过短时,由于空间位阻的原因,将阻碍两侧配体与相应的蛋白结合,以致三元复合物难以生成。当linker过长时,E3连接酶与靶蛋白无法贴近,泛素化进程将无法发生,且过大的分子量会降低PROTAC的膜通透性。另有研究表明[7],拥有刚性(如哌啶基团)或极性基团(如聚乙二醇)的linker可以改善PROTAC的药动学性质。

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图4. PROTAC中linker的结构

除了linker的结构之外,其连接位点也会影响PROTAC的选择性与活性。一般连接位点的选择原则为:1)不降低E3连接酶配体或POI配体与其受体间的结合能力;2)选择配体结合口袋的溶剂暴露区;3)连接linker时尽量确保POI配体的完整性,以避免其结合能力受到影响。图5列举了E3连接酶配体的常见连接位点(红色箭头部分)以及几种POI配体的连接位点[3]

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图5. Linker的常见连接位点



2.PROTAC的药物的代谢特征

由于其独特的结构特征,PROTAC的分子量和理化性质常常超越了类药五原则(Lipinski's Rule of Five)的限定,其代谢过程也与传统小分子药物存在显著差异。深入理解其代谢特性将有助于科研人员更有效地应对在研究其代谢产物过程中所遇到的挑战。因此,本部分将以其结构特征为出发点,对PROTAC药物的代谢特征进行深入梳理与总结。

2.1

PROTAC分子的E3连接酶配体

对其代谢的影响

Cruciani团队[7]通过三组数据对比后发现,对于靶向BET,CK2和PARP蛋白的PROTAC,在POI配体不变、linker类似的情况下,E3连接酶的配体为沙利度胺时代谢稳定性明显低于VHL配体(如图6)。Cruciani团队推测可能的原因是沙利度胺及其类似物含有多个内酰胺的结构,可能会发生非酶催化的水解反应。另一种原因可能是由于VHL配体分子量较大,导致相应的PROTAC细胞透膜性(permeability)更差[3],从而没能准确预估其半衰期。因此,对于含VHL配体PROTAC的代谢稳定性研究,肝微粒体可能是更为合适的体外代谢研究体系[8]

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图6. E3连接酶配体对代谢稳定性的影响

2.2

PROTAC分子的POI配体

对其代谢的影响

Cruciani团队[7]的研究还发现,当linker与E3连接酶配体不变时,PROTAC分子的代谢稳定性会随POI配体的变化而发生变化。如图7所示,对于以该AR受体拮抗剂作为POI配体的PROTAC,不论linker与E3连接酶配体如何变化,与其他POI配体相比,其代谢稳定性均较低。代谢产物鉴定研究发现,这一系列化合物的代谢软点主要在该POI配体上,而不在E3连接酶配体上,又考虑到该POI配体本身的代谢速率较快(半衰期为18.3 min),提示我们在PROTAC药物设计时,需考虑POI配体的代谢稳定性,不能有明显的短板。如目前已开展二期临床研究的PROTAC药物ARV-110采用了代谢稳定性较好的AR受体拮抗剂作为POI配体,其半衰期长达110小时。

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图7. POI配体对代谢稳定性的影响

2.3

PROTAC分子的linker

对其代谢的影响

在PROTAC分子中,linker是最容易发生代谢反应的部分,其主要的代谢位点为linker和配体连接的位置。Linker的长度、连接位点以及刚柔性的变化,会对整体分子的代谢稳定性产生影响。

(1)Linker的长度及连接位点对代谢稳定性的影响 

对于大部分PROTACs,随着linker长度的增加,分子的代谢稳定性会下降。如图8所示,R1为基于JQ1(BET抑制剂)和沙利度胺设计的PROTAC,当将其直链烷基linker从4个亚甲基延长为8个形成R2时,半衰期从135 min缩短为18.2 min,可能原因是更短的linker具有更大的空间位阻,进而阻止PROTAC进入代谢酶的催化位点。

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图8. 线性linker的长度对代谢稳定性的影响

研究还发现,linker和E3连接酶配体连接位点的变化也可能会对PROTAC的代谢稳定性产生影响,如图9所示。

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图9. PROTAC的linker连接位点对代谢稳定性的影响

(2)Linker刚柔性对代谢稳定性的影响

研究显示,当POI配体与E3连接酶配体不变时,使用不同的linker将两部分相连组成PROTAC分子,含哌啶环或三氮唑环linker的PROTAC相比于直链linker半衰期更长,这表明含刚性linker的PROTAC具有更高的代谢稳定性。

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图10. Linker刚柔性对代谢稳定性的影响

在linker中引入刚性结构是增加代谢稳定性的优良策略,如ARV-110的开发过程中,由原来的链状柔性linker,优化为哌啶和哌嗪环相连的刚性的环状linker,很大程度上提高了其代谢稳定性及药效。Arvinas公司的另外一个在三期临床的PROTAC药物ARV-471也采用了相同的linker[7]

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图11. 具有刚性环状linker的ARV-110和ARV-471的结构

复旦大学的王永辉课题组[9]于2021年报道了对BTK蛋白具有高降解活性的PROTAC分子6e,但其代谢稳定性较低(在小鼠肝微粒体中的半衰期为1.3 min)。2023年,他们通过提高linker刚性的策略,对一系列刚性linker及CRBN配体进行构效关系研究,将链状的聚乙二醇linker更换为含有两个哌啶环的刚性linker,得到分子3e,其代谢稳定性得到较大改善(在小鼠肝微粒体中的半衰期大于145 min),且活性优于6e

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图12. 结构优化提升PROTAC代谢稳定性及活性案例

2.4

PROTAC各部分

代谢特征与整体的关系

鉴于PROTAC是由三个关键结构组成的分子,我们能否通过其中各配体的代谢特征来预测PROTAC的代谢特征呢?为了回答这个问题,Cruciani团队[7]进行了系统的研究。如图13所示,POI配体和CRBN配体分别会发生烷基羟化和酰胺水解的代谢反应;但当通过linker把它们连接起来,形成PROTAC分子后,两个配体分子的部分均未发生对应的代谢,主要的代谢发生在linker上。另外,PROTAC分子的代谢速率与单个配体相比也有所差异。由此可知,PROTAC作为新的化学实体,无法通过各组成部分的代谢特征来预测PROTAC分子的代谢特征,需要对其整体进行代谢产物研究

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图13. PROTAC代谢特征与其各配体代谢特征的比较

2.5

PROTAC的代谢特征总结

由上述分析可知,E3连接酶的种类、POI配体的稳定性、linker的长度、连接位点以及刚柔性的变化均会影响PROTAC的代谢;PROTAC分子的代谢特征不同于其各部分配体代谢特征的加合,代谢速率也可能完全不同。

PROTAC的代谢反应类型包括其配体部分的羟基化、酰胺水解、O-脱烷基等及linker部分的羟基化、N-脱烷基、酰胺水解等;如果是PEG样的linker,还有大量的O-脱烷基反应。参与PROTAC代谢的酶主要包括I相代谢酶(CYP酶系)和常见的II相代谢酶(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)和硫酸转移酶(SULTs)等)。另外,Cruciani团队[7]发现,对于含VHL配体的PROTAC,醛氧化酶(hAOX)会参与代谢,催化其噻唑环发生羟化。由于醛氧化酶在人体中表达较多,因此针对该酶的代谢研究需要引起重视。


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结语 

经历20余年的发展历程,PROTAC以其独特的作用机制和优势,受到全球各大药企及科研机构的青睐。代谢产物研究在PROTAC药物的发现阶段、临床前研究阶段和临床阶段都发挥着重要的作用,代谢物鉴定的试验资料已经成为越来越重要的新药申报资料。药明康德DMPK依托先进的实验平台与分析软件,凭借多年的PROTAC研究经验,针对PROTAC代谢产物研究过程中的挑战制定了完善的解决策略(后面我们将发布相关的专题文章,欢迎关注),助力于全球多家药物研发企业PROTAC分子的代谢产物研究。我们希望在未来,能有越来越多的PROTAC药物进入到临床研究,最终顺利上市,为更多患者带来希望。

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