如何手动过反相柱?

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我们通常讲的柱层析一般是指正相柱层析【 柱层析技术详解 】,柱子的填料是硅胶。硅胶表面有很多-SiOH基团,因此对于大极性的化合物的吸附能力较强,柱层析洗脱时,硅胶对小极性的化合物吸附能力较弱,所以先被洗脱下来。对于一些极性超大的化合物,硅胶的吸附能力太强以至于用常用的溶剂无法洗脱下来,无法用正相柱层析进行纯化。

这种情况下就要考虑进行反相柱层析,反相柱层析最常用的填料是C18反相硅胶填料,这类反相硅胶是利用C18烷基硅烷将硅胶的 -SiOH基团封住,形成了很多C18键合微孔,对于小极性的化合物吸附能强,相反对大极性的化合物的吸附能力弱,因此和正相硅胶的洗脱顺序相反,因此称为反相硅胶。

如何手动过反相柱?   第1张

我们在进行反相柱层析时,梯度洗脱开始以大比例极性水溶液开始, 由于C18填料表面疏水性,疏水官能团就会发生蜷缩,因此使用前需要用极性有机溶剂活化(疏水官能团得以舒展),再过渡到水溶剂(保持其吸附活性)。活化平衡的步骤必不可少,否则会明显影响分离效率。

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反相Flash柱层析可以干法上样吗? 】

实验室中我们通常使用过柱机进行反相柱层析,但是如果没有过柱机,可以像正相一样手动柱层析吗?当然是可以的。区别就是C18填料有点贵,需要重复利用,别像普通硅胶一样过完直接扔掉了。下面小编分享一下加利福尼亚大学圣塔芭芭拉分校的C18反相柱层析标准操作。

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这两个化合物,含有羧基,酚羟基等大极性基团,普通正相柱层析很难分离。反相TLC监测发现分的很开,适合反相柱层析。柱层析操作过程和正相柱层析大同小异。具体细节回看往期文章【 柱层析技术详解 】。

一、首先在柱子地下铺一层1cm厚的石英砂。

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二、装入C18反相硅胶,甲醇润柱,活化硅胶,此步骤必不可少。

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三、完全润湿硅胶后,上层留少量甲醇,轻轻敲击,使填料上层更加平整。

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四、平整后,将甲醇液面压到硅胶上沿,上层加入2cm厚的沙子(有点像圣巴巴拉半岛海滩上的沙子)。

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五、用过柱体系的水相置换柱子里的溶剂,准备上样。

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一般情况下,湿法上样就可以了,最好用水相体系溶解样品进行上样,如果溶解度不好,可以加入少量的有机相促溶。上样后,加入展开剂梯度洗脱,加入溶剂时不要将上层的沙子冲散。 注意事项:由于反相柱的压力比普通的正相柱大很多,整个操作过程要在通风橱中进行,并且加压时将通风橱拉低,安全第一。梯度洗脱过程中,可以利用正相TLC监测反应,如果爬不起来可以尝试一下EA:AcOH=200:1体系。

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六、柱层析结束后,利用甲醇冲洗柱子,下次备用。

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常用的水相体系:0.1%TFA水溶液,0.1%碳酸氢铵水溶液。

有机相体系:乙腈,甲醇。

C18 Reversed-Phase Silica Gel Flash Chromatography – A Visual Walkthrough;Jeffrey J. Jackson, Zakarian Group. UC Santa Barbara.

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