如何手动过反相柱？

我们通常讲的柱层析一般是指正相柱层析【 柱层析技术详解 】，柱子的填料是硅胶。硅胶表面有很多-SiOH基团，因此对于大极性的化合物的吸附能力较强，柱层析洗脱时，硅胶对小极性的化合物吸附能力较弱，所以先被洗脱下来。对于一些极性超大的化合物，硅胶的吸附能力太强以至于用常用的溶剂无法洗脱下来，无法用正相柱层析进行纯化。

这种情况下就要考虑进行反相柱层析，反相柱层析最常用的填料是C18反相硅胶填料，这类反相硅胶是利用C18烷基硅烷将硅胶的 -SiOH基团封住，形成了很多C18键合微孔，对于小极性的化合物吸附能强，相反对大极性的化合物的吸附能力弱，因此和正相硅胶的洗脱顺序相反，因此称为反相硅胶。

我们在进行反相柱层析时，梯度洗脱开始以大比例极性水溶液开始， 由于C18反相硅胶填料表面疏水性，疏水官能团就会发生蜷缩，因此使用前需要用极性有机溶剂活化（疏水官能团得以舒展），再过渡到水溶剂（保持其吸附活性）。活化平衡的步骤必不可少，否则会明显影响分离效率。

【反相Flash柱层析可以干法上样吗？ 】

实验室中我们通常使用过柱机进行反相柱层析，但是如果没有过柱机，可以像正相一样手动柱层析吗？当然是可以的。区别就是C18填料有点贵，需要重复利用，别像普通硅胶一样过完直接扔掉了。下面小编分享一下加利福尼亚大学圣塔芭芭拉分校的C18反相柱层析标准操作。

这两个化合物，含有羧基，酚羟基等大极性基团，普通正相柱层析很难分离。反相TLC监测发现分的很开，适合反相柱层析。柱层析操作过程和正相柱层析大同小异。具体细节回看往期文章【 柱层析技术详解 】。

一、首先在柱子地下铺一层1cm厚的石英砂。

二、装入C18反相硅胶，甲醇润柱，活化硅胶，此步骤必不可少。

三、完全润湿硅胶后，上层留少量甲醇，轻轻敲击，使填料上层更加平整。

四、平整后，将甲醇液面压到硅胶上沿，上层加入2cm厚的沙子（有点像圣巴巴拉半岛海滩上的沙子）。

五、用过柱体系的水相置换柱子里的溶剂，准备上样。

一般情况下，湿法上样就可以了，最好用水相体系溶解样品进行上样，如果溶解度不好，可以加入少量的有机相促溶。上样后，加入展开剂梯度洗脱，加入溶剂时不要将上层的沙子冲散。 注意事项：由于反相柱的压力比普通的正相柱大很多，整个操作过程要在通风橱中进行，并且加压时将通风橱拉低，安全第一。梯度洗脱过程中，可以利用正相TLC监测反应，如果爬不起来可以尝试一下EA:AcOH=200:1体系。

六、柱层析结束后，利用甲醇冲洗柱子，下次备用。

常用的水相体系：0.1%TFA水溶液，0.1%碳酸氢铵水溶液。

有机相体系：乙腈，甲醇。

C18 Reversed-Phase Silica Gel Flash Chromatography – A Visual Walkthrough；Jeffrey J. Jackson, Zakarian Group. UC Santa Barbara.