改造羰基还原酶同时提高对大位阻酮底物及异丙醇的催化活力

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羰基还原酶是烟酰胺辅酶依赖的氧化还原酶,其辅因子可通过酶偶联系统或底物偶联系统进行再生,针对底物偶联辅酶循环系统,例如偶联异丙醇,由于大位阻酮底物与异丙醇巨大的结构和性质差异,通过改造羰基还原酶同时提高对大体积酮和异丙醇的活性极具挑战性。近日,中国科学院天津工业生物技术研究所朱敦明研究员和吴洽庆研究员带领的生物催化与绿色化工团队通过底物通道及活性口袋重塑的方法,同时提高了来自Sporobolomyces salmonicolor AKU4429羰基还原酶SSCR对大位阻酮底物及异丙醇的活力,通过异丙醇的氢转移反应实现了2-甲(邻苯二甲酰亚)胺-3-氧丁酸甲酯(1a)的动态动力学不对称还原,生成单一构型(2S,3R)产物,为此类底物的动态动力学不对称还原提供了一种高效的生物催化方法(DOI: 10.1021/acscatal.3c01569)。


羰基还原酶是一类烟酰胺辅酶依赖的氧化还原酶,可催化醇与酮或醛之间的相互转化。其辅因子可通过酶偶联系统或底物偶联系统进行再生,底物偶联系统例如偶联异丙醇再生辅因子,方法简单,副产物丙酮易于从反应混合物中去除,且异丙醇可以作为助溶剂,促进溶解度差的羰基底物在水溶液中的扩散。这种策略要求酶具有还原目标酮底物和氧化共底物异丙醇的活性,然而,由于大位阻酮底物与异丙醇结构大小和性质相差很大,对它们同时具有高催化活性的生物催化剂极其有限,在酶的改造过程中,在提高对大位阻酮底物的催化活力时,对异丙醇的催化活力常常会降低,所以通过蛋白质工程同时提高羰基还原酶对两者的催化活力非常具有挑战性。


本文所研究的(2S,3R)-2-甲胺基-3-羟基丁酸酯化合物是β-内酰胺类药物的关键中间体,可通过对2-甲胺基-3-氧羧酸酯(1a,1b)的动态动力学拆分还原获得,化学催化方法具有较好的立体选择性,但是反应条件苛刻。而生物催化方法报道较少,缺少合适的高效生物催化剂(图1)。


针对以上问题,研究团队希望能够利用羰基还原酶实现上述底物的高效动态动力学拆分还原,同时能够利用异丙醇做为共底物进行辅酶再生,简化反应体系。


改造羰基还原酶同时提高对大位阻酮底物及异丙醇的催化活力  第1张

图1 消旋体1的动态动力学拆分


首先以1a为底物对实验室的数百种羰基还原酶进行筛选,通过筛选发现,来自Sporobolomyces salmonicolor AKU4429的羰基还原酶SSCR可催化1a生成(2S,3R)构型产物(ee>99%, dr 70/30),其突变体M1(M242F/Q245T)展现出更好的转化率和立体选择性(ee>99%, dr 95/5)。为了进一步提高突变体的活力,作者在M1的基础上继续改造,通过同源建模,底物酶分子对接,分析相互作用关系,选取V95/F97, T134/V135, N207/Y208,P243/P244,W226, Q171构建饱和或半饱和库进行筛选,突变体M1/Q171N,和M1/Q71K的活力及选择性得到进一步提高(表1)。


表1 SSCR及突变体对1a和异丙醇的活力及选择性

改造羰基还原酶同时提高对大位阻酮底物及异丙醇的催化活力  第2张


制备反应实验表明,M1/Q171K可利用异丙醇进行辅酶再生动态动力学拆分还原1a生成(2S,3R)构型产物,20 h可转化110 g/L底物,ee值和de值均大于99%。


为了分析各突变位点的作用,构建单突变体同时测定酶比活及动力学参数(表2),结果显示M242F对异丙醇的活力提高9倍,但对1a的活力降低至1/10,Q245T对1a的活力提高近8倍,但两者组合起到协同促进的作用,相对于野生型,对1a和异丙醇的活力都有较大提高。


表2 SSCR及突变体的酶活及动力学参数

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为了进一步解释突变体对1a和异丙醇活力提高的分子机制,在晶体结构解析的基础上,与底物分子进行对接,通过M1底物通道分析(图2)和分子动力学计算(图3),表明M242F对异丙醇活力提高的原因可能是由于底物入口通道变窄,减少了异丙醇从底物结合位点的逃逸,从而增强了活性。相比之下,突变体Q245T对1a的活性是野生型酶的近8倍,这可能是由于底物结合腔的扩大。这两个突变在M1中的协同作用导致了1a和异丙醇的活性增强。

 

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2 M242F和SSCR底物通道分析

 

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图3 1a与SSCR及突变体的对接结果及分子动力学模拟结果

 

通过改造同时提高羰基还原酶对大位阻酮底物和异丙醇的催化活性,从而利用底物偶联辅酶循环系统实现酮底物的还原极具挑战性。在本研究中,考虑到(2S,3R)-2-甲胺基-3-羟基丁酸酯化合物在β-内酰胺类药物合成中的重要性,以2-甲(邻苯二甲酰亚)胺-3-氧丁酸甲酯(1a)为底物筛选一系列羰基还原酶,发现SSCR突变体M242F/Q245T同时提高了对1a和异丙醇的活性,通过进一步改造,获得突变体M1/Q171K可利用异丙醇做为共底物进行辅酶循环,实现了1a的动态动力学不对称还原,20 h可转化110 g/L底物,ee值和de值均>99%。通过对接模拟及分子动力学分析,发现这可能是由于底物通道变窄及活性口袋重塑的协同作用。因此本研究不仅提供了高效的生物催化剂,可实现1a的动态动力学拆分生成单一构型目标产物,解决此类底物动态动力学拆分难的问题,而且首次展示了可以通过蛋白质工程改造同时提高羰基还原酶对大位阻酮底物和小分子异丙醇的活性,从而通过底物偶联实现辅因子的再生。



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