薄层色谱(TLC)法常规操作方法经验小结

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薄层色谱(TLC)法常规操作方法经验小结

薄层色谱( TLC )和高效液相色谱( HPLC  )具有相同的分离原理,是依据不同物质在流动相与固定相之问的吸附和解吸速率不同来进行物质的分离。随着时代的发展,仪器分析渐渐取代传统分析,但在普通的有机合成、精细化工实验室,传统分析因其灵活多变、应用方便、成本低廉的优势仍不可完全被代替。

 

TLC法有着悠久的历史,随着经济发展,对外交流增多,很多实验室已采用商品化的薄层板。商品化硅胶板和自制硅胶板相比,具有性能稳定、重现性高的特点,可进行半定量分析。

 

TLC灵敏度高、快速、简易、性价比高、安全,操作简单,可广泛应用于医药、化工、生化、环保、公安等科研及生产单位及某些物质的定性或定量的检测,尤其是对某些微量或成分复杂的物质的分离和测定。    TLC的具体用途包括:    1.药品和制剂的质量控制和杂质检查    2.化学反应进程的控制,反应副产物的检查和中间体的分析    3.分离、纯化条件的探索    4.临床和生化检验    5.毒物分析    6.中药材品种的真伪检查和代用品的寻找    7.中草药的成分分析和含量测定等    薄层层析硅胶板是以超纯的硅胶为原料,配以独特的粘合剂以及防汽泡制作工艺而成。    产品特点:    1.优良的制作工艺,硅胶板均匀、无气泡,粘附性好,不脱落    2.高纯度、颗粒均匀的硅胶原料,金属等杂质含量少,拖尾小,分离效果好、理论塔板数高    3.批次稳定,点样斑点小、便于系列分析    4.分离时间短、灵敏度高,斑点清晰、不扩散    5.Rf值恒定    


本文主要介绍薄层色谱(TLC)法常规操作经验,包括薄层色谱的应用及自制硅胶板的注意事项和使用方法  


 

药典  

薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上,在展开容器内用展开剂展开,使供试品所含成分分离,所得色谱图与事宜的对照物按同法所得的色谱图对比,并可用薄层扫描仪进行扫描,用于鉴别、检查或含量测定。

 

薄层色谱的应用  

1.用于判断两个化合物是否相同(同一展开条件下是否有相同的移动值)  

2.用于确定混合物中含有的组分数  

3.用于为柱色谱选择合适的展开剂,监视柱色谱分离状况和效果  

4.用于检测反应过程  

5.商品化薄层板可用于半定量分析  

6.确定适宜反应温度和时间  

 

配制CMC-Na  

1. 先将称好的CMC加入所需水量的8/10,让其充分溶涨后,再加热煮沸,然后将剩余水慢慢加入。这样在煮沸过程中不易形成颗粒,煮沸时间短。  

 

2. CMC溶液的浓度0.3-0.7%比较合适,实际操作中0.4%~0.5%最为实用,浓度高了将来显色时如果有加热过程稍不小心板子容易发黑,浓度低了铺出来的板子不结实,轻轻一碰就掉渣,不好保存,而且点样时会很紧张,容易出洞。0.5%CMC-Na与水浴溶涨至充分搅拌溶涨,如果不好溶涨,可在溶胀前加几滴乙醇,比较好溶,但是尽量不加,因为加入乙醇后使CMC-Na的粘合性降低。  

 

4. CMC-Na溶液煮了以后不能再用冷水兑,否则,几天以后就会变绿,起霉。注意放置时间太长的CMC-Na溶液可能会发黄,而且可能有霉菌出现,绝对不能再使用。  

 

5. 在CMC-Na的溶解过程中,可以使用可进行加热操作的磁力搅拌器,大概搅拌5小时,应该可得到满意的效果。而且这样就可以使CMC-Na溶解,并且溶液更澄清。如果有抽滤装置你可以直接把CMC-Na溶液滤过,就可以不必等它沉淀再取上清液了,还有两个好处一是节省CMC-Na溶液,二是倒滤过的CMC-Na溶液的时候不必担心会把下层的不溶物倒出来了!  

 

6. 过滤CMC溶液,在布氏漏斗上平铺薄薄一层脱脂棉,千万保证每个小孔都没漏掉哦!用蒸馏水润湿脱脂棉,启动真空泵,抽紧后就可以放心大胆的倒CMC溶液了,保证滤过的溶液澄清透明,而且长时间放置不沉淀。CMC-Na后处理,很多人说是过滤,或者抽滤,我觉得可能速度很慢,而且又容易浪费。我的做法是离心,5000rpm离心20min。倒出上清液,非常清,也同时消除了过滤过程中可能发生的污染。  

 

关于薄层板的要求  

1.载板要求平滑清洁,没有划痕,在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤,再用水冲洗干净。  

判断载板是否干净的标准:拿在手上立起来,如果发现水不是呈股流下,而是呈瀑布状态流下,那么说明你的玻璃已经洗干净了。真正洗干净的玻璃,很快就可以晾干。

 

3.清洗用过后的薄层板,可用洗衣粉、洗洁净,反复洗数遍,如果仍然挂水珠,可用洗液泡。如果还解决不了那就只好放弃这块玻璃板了。  

 

关于研磨及铺板要求  

1. 取薄层层析硅胶重量与CMC-Na的体积比为1:4的比例(该比例能使硅胶板铺出的效果较好不至于掉渣也不至于板太硬)充分混合碾磨,至拿起碾锤能看到混合液与碾锤有一定的粘连。即好。  

 

2. 硅胶的研磨,必须是一个方向,可以适量的加入一定量的无水乙醇或丙酮来消泡,也可以适当搅拌后放在干净容器内超声,效果都是不错的。

 

3.依据薄层板使用需要,将适量研好的吸附剂倒到薄层板上,先用小锤将吸附剂荡匀,倾斜层析板,使吸附剂流至层析板一侧,待吸附剂蓄积一定量后,再反向倾斜层析板,使吸附剂回流;然后是另外两个方向,重复上述操作,后轻颠几下薄层板即可。  

 

4. 铺板时,可以顺着板中间倒,也可以顺着某个边缘倒,也可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上,倒时也要注意不要引入小气泡。如有需要,可以双手10个指头托住玻璃板,有节奏的颠簸,使得糊状硅胶分布匀称。尤其是载板的四个角,容易高出玻璃板其他部位,所以要格外注意。颠好的板,表面看上去要光滑平整,没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平的台面上,否则难保证板面硅胶的厚度均匀。

 

5. 铺制好的薄层板先让其稍干后,即看不出有明显的水印,放入烘箱内用50度以下的温度并开鼓风干燥30分钟,再升温干燥至干,注意升温过快在使用的过程中有可能发生起层的现象不利于分离,以上方法经本人两年多的实践效果较好且耗时又不太长。  

 

6. 10g吸附剂加入3滴95%乙醇以驱赶气泡。  

 

关于展开剂  

1. 分离的样品酸性比较大,一般在展开剂中加酸  

 

2. 加甲酸是因为该样品是酸性的,加酸的量和该物质的酸性成正比关系,加水可能是因为你的样品是苷类的用酸水做一下缓冲,目的就是让斑点圆滑,不脱尾,展距良好。  

 

3. 饱和也非常重要,边缘效应很严重的不妨用下端浸在展开剂中的滤纸贴在展开缸的内壁,这样饱和效果会好一些。  

 

4. 1)在层析缸口涂适量凡士林,增加密封性;2)以展开剂边缘效应的大小,确定展开剂平衡时间的长短,一般平衡时间在30分钟即可。  

 

5. 有机溶剂的极性,甲醇>氯仿,因此在氯仿:甲醇:氨水 (10:1:0.6)这个展开剂中,如果极性略大,可适当降低甲醇比例;如极性太小,可适当增大甲醇比例。另外还有一个问题,这个展开剂中,甲醇用量较小,而甲醇又易挥发,容易产生边缘效应,要特别注意展开剂的平衡和层析缸的密封。  

 

6. 不同的展开系统意思是其中至少应该有一种溶剂不同(最好是不同分类组的溶剂),而不是比例不同。或者使用不同的固定相。  

 

关于显色  

 

1. 在工作中研究过用硫酸乙醇显色作定量分析的品种,但凡加了CMC的板都易烘糊,尤其是温度高于100度时,后改用不加CMC辅的水板来作,就不会有烘糊现象,故也可推论CMC易于与硫酸起糊化反应。  

 

2. 但凡加了CMC的板都易烘糊,尤其是温度高于100度时,若改用不加CMC辅的水板来作,就不会有烘糊现象,但不加CMC辅的板又太软,点样时容易点出洞,有个好办法是将CMC的浓度调至0.1%,这样就不易烘黑的。  

 

3. 关于薄层板加热变黑的问题,其实很容易解决:当喷完显色剂后不用在放烘箱里烘了,可以用电吹风在板子背面吹吹就能显色了。我们实验室里一般都采用此法,简便、快洁,果一非想使用烘箱烘的话,一定要用带玻璃窗的,当看到显色了就取出,不然不好控制显色时间,时间过长,CMC容易碳化变黑。  

 

4. 薄层版变黑与CMC-Na的浓度过大有关,如果你留意的话,你会发现,当显色剂中有浓硫酸时,加热时间稍长就会变黑(其他显色剂是没事的),我老师说这是因为浓硫酸把CMC-Na炭化了,其这种情况你只要适当降低CMC-Na的浓度就可以了,当然如果不加CMC-Na的话容易把板弄破。  

 

5. 一般我都是显色后用电吹风吹的,要均匀吹,电吹风离板的距离要远些,防止部分会黑。另还要注意显色剂,如果显色剂中含有硫酸,加热时间一定要掌握好,不可太长。

 

关于点样  

1. 点样我本人没有什么技巧,导师教了我一招挺好用,写出来大家分享,就是在点样时食指放在点样管的上端,当点样管的下端与硅胶板接触的瞬间轻轻松动上端的食指,溶液自然从点样管出来,迅速提起点样管,就这样反复操作点出的斑点既小又均匀。但要提出样品溶液不能太浓,浓度太大,点下的样品不能被硅胶很好的吸收,不利于分离。  

 

2. 关于点样,我上学的时候,老师用比较便宜的进样器(大约10几块钱吧,10μl即可),将针尖打磨圆滑,老师好像是用锉一点一点锉的,这样点样的时候样品溶液不容易沿针尖上行(甲醇溶液都这样),并且针尖不会刺破已经铺好的薄层板。现在,我和师兄都是实行的这个办法,还是比较实用的,点样量可以精确到0.5µl。当然,点样的时候手不能抖动,动作要轻,这些要领在于意会,逐渐锻炼,相信你会体会到其中的快感。

 

3. 要磨平微量进样器的针尖,简单的方法就是,在展缸的盖子上轻磨(当然是靠近中间部分),就很快能解决问题,且很平滑。  


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