复杂善变的天然绿:绿色食品中的绿色秘密

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随着时代发展,人们有了更高的健康要求。于食品着色剂而言,天然来源的着色剂(如提取自可食用的水果、蔬菜、花卉、藻类等)备受青睐。伴随这一趋势的是世界各国食品监管部门对食品着色剂日趋严格的质量安全标准。在食品工业中,绿色素是最具研究挑战性同时也是研究最少的天然着色剂之一。以往研究表明,所有天然的绿色食品着色剂几乎都基于叶绿素(chlorophyll)发展而来,比如市面上最常见的叶绿酸铜(copper chlorophyllins,也称“叶绿素铜钠盐”)。这种着色剂的生产过程包括用溶剂从天然食用来源直接提取叶绿素,然后进行化学水解,这些叶绿素被统称为叶绿酸(chlorophyllin);接下来,这些叶绿素通过添加铜盐生成钾和/或钠金属配合物,以产生更具极性更稳定的叶绿素,并保持永久的绿色。由于叶绿素具有结构多样(存在立体异构体)且敏感易变的特性,在天然绿色素中常以混合物的形式存在,这导致绿色素中有相当数量的叶绿素成分未准确鉴定出来。最近,西班牙研究人员基于实验和计算的质谱联用技术,解析天然绿色素中的叶绿素成分,为此类天然色素成分分析提供了一种有效可行的方案。

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图1. 食品着色剂叶绿酸分析。图片来源:Food Chem.

他们选择市售的5种常见叶绿酸铜络合物类食品着色剂和3种着色食品作为研究对象,分别命名为样品A-H。样品运用液相色谱-串联质谱(HPLC-ESI-hrTOF-MS2)技术进行分析,所获质谱数据通过专家策划数据库(expert-curated database)类型的质谱库(MS library)进行检索比对,并通过相关软件工具、过滤规则、算法进行评估。

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图2. 样品叶绿酸成分分析的实验方案。图片来源:Food Chem. 

作者利用实验获取的色谱图、结合相关过滤规则和质谱库数据,从样品A-H中精确鉴定出5种叶绿素,它们是chlorin e6、rhodin g7、152-methyl-chlorin eester、chlorin e4 和isochlorin e4Chlorine6作为色素在绿色食品中已得到系统认可,rhodin g7 是chlorin e6 的b系列对应物,此前从未在市售食品着色剂中报道存在,这也是报道中首次通过串联质谱数据和相关算法将其鉴定出来。152-methyl-chlorin e6 ester此前被报道存在于橄榄油中,chlorin e4 和 isochlorin e4是一对立体异构体,在本文实验条件下无法准确区分。除这5种叶绿素以外,他们利用文献支持数据库还发现了一些以前未在食品色素中鉴定出的叶绿素,如purpurin 5a、rhodin g5、isorhodin g5151-hydroxymethyl rhodochlorin δ-lactone a、chlorin p6、chlorin k、pyropheophorbide b、rhodochlorin a、purpurin 18a。

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图3. 本研究中分析样品的色谱痕迹。图片来源:Food Chem.

作者开发出专家策划数据库,以鉴定绿色素加工过程产生的未知叶绿素结构。他们的数据库涵盖a、b系列叶绿素,考虑到b系列往往被低估,本实验将重点放在b系列产物的检测上。基于这些数据和规则,他们一共鉴别出6种产物,即化合物rhodin r7、purpurin 5b 或15-keto-isorhodin g5 或 15-hydroxy-methyl rhodochlorin δ-lactone b、rhodochlorin-15-oxymethyl-δ-lactone b、152-methyl-isorhodin-g5、rhodochlorin a、purpurin 18。其中,rhodin r7的色谱数据与chlorin p6接近,但极性略高于chlorin p6,第二化合物的色谱数据与三个叶绿素异构体purpurin 5b、15-keto-isorhodin g5 和15-hydroxy-methyl rhodochlorin δ-lactone b吻合,且进一步计算也无法区分。第四个化合物的色谱数据与两个异构体吻合,但是经过MS2质谱数据分析后,排除一个异构体,确定为152-methyl-isorhodin-g5

绿色素成分的复杂部分原因是加工工程中易于发生化学变化。以往研究表明,在极性绿色食品着色剂的加工过程中,往往伴随着叶绿素成分C17位酯基的碱性水解和溶剂萃取。作者基于以往和自身的研究成果,对绿色食品着色剂在加工过程中的化学变化进行了推测。他们认为,着色剂中的a、b系列叶绿素在碱性水解条件下会平行发生一系列化学反应,例如氧化、脱镁、脱羧等,但在反应动力学上b系列叶绿素反应速率更低。叶绿素在碱性条件下C17位水解释放植物醇,其中央镁离子被氢离子取代形成脱镁叶绿酸盐,C13位的亲核中心在碱性条件下易于烯醇化,反应路径因有无氧气参与而不同。有氧条件下,a系列叶绿素完全转化为chlorin类化合物(例如 chlorin e6),b系列叶绿素则转化为rhodins化合物(例如rhodin g7),进而通过脱羧等方式产生一系列衍生物。a、b系列叶绿素通过C13位过氧化中间体完成环重排,分别形成a、b系列的chlorin k,在强碱条件下,a、b系列叶绿素会形成purpurin 18a及一系列衍生化合物。

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图4. 推测的绿色着色剂或绿色食品中叶绿素的化学反应路径。图片来源:Food Chem.

基于这些化学反应路径,我们对不同绿色食品着色剂或着色食品有了更清晰的认识。例如,文中的食品着色剂A、D、E和着色食品F的加工过程应该非常相似,因为其反应中衍生出几乎所有已鉴定的叶绿素。随着相关信息的进一步开发,食品制造商可以有效管控加工工艺中发生反应的程度和最终产品中化合物的氧化状态,食品监管部门也可以基于科学数据制定新的绿色纯度和安全标准。


Comprehensive chlorophyll composition of commercial green food colorants and coloring foodstuffs by HPLC-ESI-QTOF-MS/MS: Chlorophyllins
Antonio Pérez-Gálvez, María Roca
Food Chem., 2023415, 135746, DOI: 10.1016/j.foodchem.2023.135746



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