扩展共价药物的“弹药库”

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共价药物在2022年底抗击Covid-19疫情中扮演了中流砥柱的角色。辉瑞的抗SARS-CoV-2病毒药物Paxlovid对于抑制疫情起到了极为重要的作用。Paxlovid中有效成分之一nirmatrelvir就是一款共价药物,能够结合在SARS-CoV-2病毒增殖过程中发挥重要作用的蛋白3C样蛋白酶蛋白(3CLPRO,亦称Mpro)从而抑制病毒增殖。这个抑制过程并非传统药物的药物分子与靶标的非共价结合方式,nirmatrelvir分子上的亲电氰基与Mpro蛋白上Cys145残基的侧链巯基之间共价结合,产生硫代亚胺酸脂(thioimidate),从而结合靶标实现药效(图1)。由于是共价反应,该药选择性更高,药效更强。

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图1. 抗SARS-CoV-2病毒药物nirmatrelvir,以及其共价结合机理。

其实共价药物并不是新生事物,在药物历史上具有里程碑意义的药物中,有一些就是共价药物,例如1899年问世的阿司匹林和1928年的盘尼西林。它们分别靠乙酰水杨酸酯和β-内酰胺四元环充当亲电“弹头”,与靶标上的亲核基团发生共价反应,抑制靶标的生物学功能(图2)。

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图2. 阿司匹林作用机制。

共价药物发展史可谓英才辈出,涌现出的重要共价抑制剂药物参见图3。

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图3. 共价药物发展史上重要的药物代表(红色结构为亲电弹头)。图片来源:Drug Discov. Today

共价抑制剂设计要点

共价抑制剂最重要的优势之一,在于它们比非共价抑制剂更高的选择性。药物的毒性也与选择性之间存在重要关联。共价药物的选择性和毒性主要由三个方面决定:弹头的亲电性、目标残基的亲核性以及药物配体-靶标之间的非共价作用。

弹头亲电性在共价抑制剂选择性方面起到极其重要的作用。高反应性亲电试剂通常表现出较低的选择性,这是因为它们也容易攻击除目标靶标之外的细胞其它部分。这可能导致有毒产物或加合物的形成,从而引发毒副作用。鉴于过高的亲电性可能导致脱靶效应,人们通常优选具有较低反应性的弹头。在与靶标初始非共价结合之后,目标的共价反应应该仅与目标靶标的亲核基团进行,从而降低脱靶效应和毒性。例如在一项研究中,科学家发现用富马酸叔丁酯取代丙烯酰胺弹头可减少 70% 的脱靶率。富马酸叔丁酯弹头较大的空间体积阻碍了不希望的反应,但保持了原始弹头的反应性。与靶标的非共价相互作用也赋予抑制剂选择性。为了实现高选择性,非共价结合应该足够强,以选择性地与其靶标结合,并且实现高停留时间。

共价抑制剂亲电弹头

如上文所述,共价抑制剂药物的弹头通常是亲电的,针对各种亲核蛋白质残基,最常见的是半胱氨酸和赖氨酸残基,也包括组氨酸的咪唑基团。图4显示了根据三个数据库(CovalentInDB、WHdb、CovPDB)中与共价抑制剂作用的氨基酸残基数量(其中包括了该氨基酸位于多肽N-端的情况,例如Val)。大多数弹头以半胱氨酸、丝氨酸和赖氨酸为目标。但靶标范围已显著扩大,21个氨基酸中有 16 个被共价靶向。CovalentInDB 还提供了有关针对辅助因子的共价弹头详细信息,这可能代表了一种新颖的靶向策略。最常见的亲电弹头包括丙烯酰胺、氯乙酰胺和腈,它们已经出现在很多上市共价药物之中,例如nirmatrelvir中的氰基。

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图4. CovalentInDB,WHdb 和 CovPDB数据库中,与共价抑制剂作用的氨基酸残基分布图。图片来源:Drug Discov. Today

靶向半胱氨酸的共价弹头

半胱氨酸是共价抑制最常见的氨基酸靶标,其巯基pKa 8.4,接近生理pH,因此半胱氨酸的部分巯基是以去质子的thiolate状态存在的,这大大增强了它的亲核性和与亲电试剂的反应活性。在介电常数较高的极性环境中更倾向于发生半胱氨酸的亲核加成,因为反应基团上的电荷在更大程度上局域化,利于稳定thiolate并有利于它的亲核反应。然而在疏水口袋中,半胱氨酸不易极化,因此不易发生亲核反应。蛋白质表面半胱氨酸能够实现更大的极化,并且提供更大的空间来容纳各种亲电试剂,因此是最优选的。除了环境的极性和 pH 值之外,位置还控制着半胱氨酸的反应程度。靶向半胱氨酸的共价抑制剂亲电弹头包括迈克尔受体、腈、环氧化物、醛、卤代乙酰胺。其反应机理如表1-4所示。分别对应亲核取代、亲核加成、加成-消除和氧化反应机制。

表1. 通过亲核取代机制操作的半胱氨酸靶向弹头

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1. 亲核取代机制

弹头3(β-杂芳基巯基乙酰胺)和弹头4(苯硫酚酮)分别针对常见共价弹头丙烯酰胺和酮的性质而开发。3是丙烯酰胺的生物电子等排体,其杂芳基取代基介导的可控反应性,能够实现更持久的抑制,还表现出较高的生理稳定性。相比之下,4是酮类不可逆共价抑制的首个例子,其中苯硫酚结构可以实现可逆抑制过程,因为它可以稳定硫代缩酮中间体。与传统的α-卤代甲基弹头相比,弹头4具有较高的特异性。溴代环丁烯胺酮5具有高水稳定性和生物利用度,其二甲基降低了母环的亲核性,使得只有溴被裂解,而氨基通过给电子来调节反应性并降低双键的亲电活性(迈克尔加成反应受体),从而降低 的整体反应性。

磺酰吡啶弹头 6a 和 亚砜吡啶弹头6b 通过吡啶上的砜/亚砜取代实现可调节的反应性,吸电子磺基团激活吡啶以进行 SNAr 反应。在硝基呋喃弹头7中,改变C4位置的取代基会改变弹头的反应性。SNAr弹头67都表现出高半胱氨酸选择性。硫醇取代的1,2,4-三唑基可以作为氯甲基弹头8的激活基团。用吸电子基团对 R1 基团进行修饰可增加反应活性,为弹头提供了调节空间。二卤乙酰胺 的开发是为了提高常规单卤乙酰胺弹头的选择性。由于氯氟乙酰胺 9a 中氟的吸电子性质,在C原子上感应出正电荷,从而减少了碳-氯键长度,导致弹头的亲电性降低。9a 的作用是可逆的,而二氯乙酰胺 9b 可以通过不可逆的机制起作用。羟胺弹头 10的安全性仍有待研究。硫代甲基四嗪 11 最近被鉴定为三合一共价抑制剂:(1)可逆共价半胱氨酸弹头;(2)与反式环辛烯(TCO)发生双正交反应,形成稳定的加合物,转化为不可逆共价弹头;(3)可通过与 TCO 的双正交反应用于荧光标记。

2. 亲核加成机制

表2. 通过亲核加成机制作用的半胱氨酸靶向弹头

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以迈尔克加成反应为代表的亲核加成反应,是传统的丙烯酰胺类共价抑制剂与半胱氨酸产生共价结合的机制。随着人们对可逆共价抑制剂认识的不断加深,新型的亲核加成弹头也不断涌现出来。芳香族三氟甲基酮 15与 FGFR4 受体的 Cys552 表现出可逆共价结合,并且对硫醇表现出选择性。苯并噻唑基酮弹头 16曾用于开发抗 SARS-CoV-2 药物,可与3CL 蛋白酶的 Cys145 可逆结合。在被并入多肽骨架后,该抑制剂表现出优异的安全性,中度 CYP 抑制作用,无心脏毒性,也无致突变性。这表明有可能将这种弹头纳入进一步的共价药物发现活动中。在研究黄酮类化合物抑制Mpro的过程中,研究人员发现连苯三酚 17也是一种共价弹头。在氧化条件下,连苯三酚被氧化为邻苯醌形式,这是一种迈克尔加成反应受体,可与半胱氨酸靶标发生反应。连苯三分弹头与半胱氨酸的共价反应有很高的目标选择性,其反应性由氧化环境控制。与 α,β-不饱和羰基体系类似,炔烃也会发生迈克尔加成。炔烃通常连接在缺电子杂环上,因为它们有助于稳定负电荷并增加反应性。新开发的炔基弹头的分子实体包括18-21,它们具有高选择性。在炔基嘧啶 19 中,吸电子的嘧啶降低了炔基的亲电性,使其能够与不耐受高极性丙烯酰胺弹头的靶标相互作用。炔基噻唑20可调节炔基弹头的反应性,2-位的取代降低了电子密度,从而增加了弹头的亲电性。通过改变炔烃亲电性,杂环或环稠合也有助于调整反应性。尽管膦酰胺衍生物 21a 和 21b 仅应用于生物缀合和装订肽,但由于其高半胱氨酸选择性、易于合成和高化学稳定性,它们也有望用于共价抑制应用。这些弹头中 R1 位置的吸电子基团有助于调控弹头反应活性。

3. 加成-消除机制

表3. 通过加成-消除机制作用的半胱氨酸靶向弹头

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研究人员发现,α-取代甲基酮与靶标之间的不可逆反应与离去基团的pKa有关。这个发现催生了α-酰氧基甲基酮亲电弹头22的产生。22具有可调节的 pKa 和反应活性,其中的杂芳酯基团增加了极性表面积(PSA, polar suface area),有助于优化药物分子的物理化学性质。弹头23在共价接合后释放完整的糖精,可应用于果糖 1,6-二磷酸酶 (FBPase) 的共价抑制。而在加成-消除过程中释放的糖精,本身也是一个共价抑制剂,可用于碳酸酐酶抑制。23的应用因此可以达到双重靶向目的。通过共价靶向释放糖精是一个新概念,可用于将糖精这样本身的共价抑制剂整合到大的共价抑制剂中,通过与靶标的共价反应将其释放,进一步引发位点特异性的共价抑制反应。碳酸酯 24 和氨基甲酸酯 25均表现出可逆共价结合、高半胱氨酸选择性和低反应性。二芳基碳酸酯24可以酰化去泛素酶靶标,形成动力学稳定的硫代碳酸酯中间体,该中间体经历缓慢的二酰化,从而表现出持续的抑制作用。二硫代氨基甲酸酯 25 对硫醇(例如谷胱甘肽)表现出低反应性。三卤乙酰胺弹头 26 具有更大的空间位阻,半胱氨酸硫醇攻击羰基(而不是直接进攻 β-碳)产生硫代半缩酮中间体,然后进行1,2-位移以取代一个溴化物。

4. 氧化机制

表4. 通过氧化反应机制作用的半胱氨酸靶向弹头

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二硫烷基苯甲酰胺 27 有一个二硫键,可以与半胱氨酸的巯基发生thiol-disulfide交换反应,从而进行共价结合。硫代磺酸盐28通过独特的氢键激活机制,它与附近的组氨酸残基形成氢键会导致 S-S 键极化,从而更容易与半胱氨酸反应。这种机制增强了28选择性,使其倾向于半胱氨酸蛋白酶 (CP) 而不是丝氨酸蛋白酶 (SP) 结合。在CP中,组氨酸以质子化形式存在,因此很容易与28形成氢键(组氨酸作为氢键供体)。1,2,4-噻二唑 29可以通过可逆结合的方式抑制SARS-CoV-2病毒Mpro 蛋白酶的Cys145。R1、R2 和 R3基团调控弹头的反应活性。29本身显示出高反应性,通过R2和R3位置的对位卤素取代增强了反应性。值得注意的是,29 还表现出高细胞渗透性。硫氰酸盐30用于共价靶向CC 趋化因子受体 2 (CCR2) 和 SARS-CoV-2病毒的Mpro 蛋白酶。研究证明30是一种不可逆的半胱氨酸选择性弹头,反应性低,安全性高。


The expanding repertoire of covalent warheads for drug discovery
Namrashee V. Mehta, Mariam S. Degani
Drug Discov. Today202328, 103799. DOI: 10.1016/j.drudis.2023.103799


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