如何制备高质量核磁测试样品

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在各种各样的化学分析仪器中, 核磁共振谱仪被公认为是一种非常重要的研究和测试工具, 它的许多功能是其它手段无法代替的。1945年Bloch和Purcell分别领导两个小组同时独立地观察到核磁共振(NMR),二人因此荣获1952年诺贝尔物理奖。历经半个多世纪,NMR已从最初发现到最终发展成为成熟的医用的MRI影像学检测手段,期间6次被授予诺贝尔奖(物理、化学、生理/医学),堪称史上获奖次数最多的技术。


自1953年出现第一台核磁共振商品仪器以来,核磁共振在仪器、实验方法、理论和应用等方面有着飞跃的进步。谱仪频率已从30MHz发展到1100MHz。谱图已从一维谱到二维谱、三维谱甚至更高维谱。所应用的学科已从化学、物理扩展到生物、医学等多个学科。总而言之,核磁共振已成为最重要的仪器分析手段之一。



如何制备高质量核磁测试样品  第1张


NMR常用内标物

氢谱:非水溶剂四甲基硅烷(TMS)水溶液为2,2-二甲基戊硅烷-5-磺酸钠(DSS)

碳谱:四甲基硅烷(TMS)或者氘代试剂中的碳峰

 

TMS优点:

TMS分子中12个1H处于完全相同的化学环境,只产生一个尖峰,少量的TMS即可测出NMR信号;屏蔽强烈,共振吸收峰位于谱图最右端。与有机化合物中的1H峰不重叠;化学惰性;易溶于有机溶剂;沸点低(27℃),样品易回收。

硼谱:乙醚三氟化硼或者三甲氧基硼

磷谱:85%磷酸(但只能作为外标)

锂谱:4M高氯酸锂溶液

钠谱:1M氯化钠溶液

硅谱:四甲基硅烷,但在低频区则用四乙基正硅酸酯

NMR常用同位素核有关物理参数


a 磁旋比的单位是107弧度/特斯拉/秒

b 共振频率以1H频率为100MHz作参考

c 检测灵敏度以1H为1作为参考,并考虑了同位素的天然丰度。

请大家记住:无论内标还是外标,实际化学位移值随温度变化而变化,而标准物本身就受温度的影响。如温度每改变30K,TMS质子共振信号将变化0.1 ppm。因此,如果做变温试验,最好标明详细的实验过程。

NMR所需样品量

在核磁共振实验中,样品的量控制也是一门学问,有的产品是多步合成的,很宝贵,例如全合成产品。对于氢谱,3到10毫克样品足够。对于分子量较大的样品,有时需要浓度更大的溶液。但浓度太大会因饱和或者粘度增加而降低分辨率。对于碳谱和杂核,样品浓度至少为氢谱的5倍(一般在20-500毫克左右)

对于二维实验,为了获得较好的信噪比,样品浓度必须够。根据经验,25毫克样品足以完成所有实验,包括氢碳相关HMBC实验。如果样品只有1到5毫克,只能完成均核氢氢相关实验,是与碳相关的实验至少需要过夜。保持样品高度或者体积一致。这将减少换样品后的匀场时间。对于5毫米核磁管,样品体积应为0.6毫升或者样品高度为4厘米。

样品和样品管

样品:纯净,干燥,溶液内无灰尘或沉淀,尤其不应含有铁磁性杂质。特殊条件下需要过滤或除氧。黏度不要过高(影响驰豫时间),黏度越大,分辨率越差,样品可适度稀释来提高分辨率。

溶液内的灰尘会使谱线明显变宽而降低分辨率,再好的匀场也无法解决该问题。

样品管:匀质,清洁,不携带铁磁性物质。不要用洗液洗涤,以免带入很难除去的顺磁杂质。不要在温度太高的烘箱里直立烘太久。

样品管的直径:

5mm 最常用

3mm 用于样品量很少的样品

10mm 用于观测低灵敏度核或溶解度受限制的样品

溶液体积:

5mm probe       0.4-0.6ml

3mm probe       0.1-0.15 ml

样品管处于合适的高度,使样品处于磁场的最强且最均匀的部分。

足够的溶液高度,3.5~5cm。


如何制备高质量核磁测试样品  第2张


对于5毫米核磁管,样品体积应为0.5毫升或者样品高度为4~4.5厘米。太低的溶液高度使匀场所需时间大大增加,而且很难得到高质量的谱图。不要为了增加浓度而过分缩小溶液的体积。

谱仪的磁场强度越高,仪器灵敏度也高,对于污染物、样品制备不好和不好的样品管的灵敏度也增加。

选择合适的氘代溶剂

  • 谱议靠氘信号锁场和匀场,一般要求:惰性,低沸点,价格尽量便宜首要规则,氘代原子越多,价格越高。

  • 溶解度:越大越好,以增加实验的灵敏度。

  • 溶剂信号对样品的干扰:越小越好,尽量不与谱峰范围重叠。

  • 温度可靠性:在实验温度下不会挥发或凝固,溶解度不会受太大影响。比如,D6-DMSO凝固点18.4度,如果实验室不是恒温的,冬天凝固很正常温度低会发生凝固。

  • 粘滞性:粘滞性越小,分辨率越好

  • 水含量:几乎所有核磁溶剂里都有痕量或更多的水,水的存在会降低谱图的质量。

  • 带活泼氢的试样尽量选择不含活泼氢的试剂,避免该峰因氢氘交换而无 法在图谱中表现出来

  • 适当的芳香氘代溶剂有可能简化图谱

如何制备高质量核磁测试样品  第3张


首选溶剂:CDCl3,尖锐的单峰,7.26ppm,沸点 60.8°C,100ml ¥520

其它常见氘代溶剂:CD3COCD3,CD3OD,DMSO-d6(可以打出活泼氢),C5D5N

准备样品

1.  尽量直接把 NMR 溶液过滤进样品管避免沾染灰尘和其他污物。

2. 拿住样品管是要拿住上部。

3.  实验过程中的溶剂残留也是影响图谱质量的很大因素。常见的有石油 醚、乙酸乙酯等溶剂。

4. 对于氢谱,3 到 10 毫克样品足够。对于分子量较大的样品,有时需要浓度 更大的溶液。但浓度太大会因饱和或者粘度增加而降低分辨率。

5. 对于碳谱和杂核 谱,样品浓度至少为氢谱的 5 倍(一般在 100 毫克左右)

6. 对于二维实验,为了获得较好的信噪比,样品浓度必须够。根据经验,25 毫克样品足以完成所有实验,包括氢碳相关 HMBC 实验。如果样品只有 1 到 5 毫克,只能完成同核氢氢相关实验,与碳相关的实验至少需要过夜。保持样品高度或者体积一致。这将减少换样品后的匀场时间。对于 5 毫米核 磁管,样品体积应为 0.6 毫升或者样品高度为 4 厘米。

7. 保持样品高度或者体积一致。这将减少换样品后的匀场时间。

8. 盖上样品管,使用封口膜密封减少蒸发。




做核磁的时候为何要加氘代试剂

1)用一句话来回答氘代试剂的作用,那就是为了准确的锁场。化合物中H共振频率是与仪器里面的磁场强度相关的函数,通常我们指的400 M核磁仪器,对应的磁场强度时9.4T,这里的400M是在这个强度下H核的共振频率,另外化合物的共振频率还会轻微的受到化合物的化学环境影响,比如同样在 9.4T的磁场强度下面,CH3OH,里面的 CH3的在核磁谱图上是出峰子啊3.6左右,而CHCl3中的氢出峰在 7.26左右,两个峰在化学位移上好像差别挺大,差不多 4个 ppm,转化为频率的差别就是 4 ppm* 400M= 1600 HZ, 相对于400M的这个共振频率,这个量是非常小的 只占到 百万分之4.

2)核磁里面的磁场强度之所以需要去非常准确的锁定,核心原因是,我们测试化合物里面的H的共振频率都是几乎完全一样的,在9.4T的磁场强度下几乎都是 400 M核磁,为了要准确区分由于化合物化学结构的差异,造成的核磁共振频率的变化,那么一定要在非常均匀稳定的磁场环境下,才能获得测试这个微小差异的可能。

3)举例说明这个工作机制,比如我们使用氘代甲醇做溶剂,那核磁仪器有一个通道就可以用来接收氘核的频率信号,氘代甲醇的氘在9.4T的磁场强度下,其共振信号是一个常数,如果由于仪器超导原因(偶然因素),磁场发生微小的变化,那检测器检测到的氘的频率信号就会跟着发生一个微小变化,仪器这个时候会自动启动匀场线圈(这个就是大学里面学的罗线圈,不是超导体,可以产生微小磁场),来维持磁场强度稳定在9.4T,这样就确保在在一个HNMR整个测试过程当中,都是在一致的磁场强度,以及准确的磁场强度获得的数据。

4)为何做核磁的时候我们需要准确的登记所用氘代试剂的种类呢?这个原因其实和上面第二点里面说的理论是一致的,虽然不同氘核的共振频率是基本一样的,但是还是会受到化学结构的一些影响,不同氘代试剂的试剂共振频率都是不一样的,如果登记错误的氘代试剂,会造成整个谱图的化学位移,一起平移几个ppm单位,这对于氢谱来说是不能允许的,因为99%的化合物的H的化学位移都在0-20 ppm这个区间。

5)那么如果我的样品单一氘代试剂不能溶解,是否可以使用混合氘代试剂呢,答案是肯定的,登记进仪器的时候,登记那个浓度高一些的作为溶剂即可,因为混合溶剂中的氘照样可以帮助到仪器准确锁场,只是期浓度比以前稍微下降了一点而已,不妨碍仪器准确锁场,这个同样适用于定量核磁。


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